Denis Wolf1, Majda Globokar Vrhovec2, Klaus Failing3, Christophe Rossier4, Carlos Hermosilla1 and Nikola Pantchev2
1 Institute of Parasitology, Justus Liebig University Giessen, Germany.
2 IDEXX Vet Med Lab, Ludwigsburg, Germany.
3 Unit for Biomathematics and Data Processing, Justus Liebig University Giessen, Germany.
4 Institute of Animal Pathologie, Vetsuisse Faculty, University of Bern, Switzerland
Предпосылки
Количество рептилий, которые содержатся в качестве домашних животных, растёт во всём мире, в связи с этим возникает множество серьёзных проблем в отношении благополучия этих животных, связанных с торговлей ими и наличием паразитов у рептилий [1, 2]. В то время как одни виды рептилий, продаваемые владельцам, разводятся в неволе, другие изымаются из дикой природы или же являются потомками пойманных животных. В первую очередь экзотические рептилии, происходящие из дикой природы, могут быть заражены различными паразитами, включая зоонозные виды, например, пентастомы Armillifer armillatus [3, 4] и Porocephalus spp. [5, 6], а также цестод Spirometra spp. [7–9].
Рептилии являются носителями широкого спектра внутренних паразитов, включая различные виды простейших, нематод, цестод, пентастомид, скребней и трематод [10–17]. Тщательное копрологическое исследование на предмет инвазий паразитов является важной частью ежедневной работы ветврача, целью которой является здоровье и благополучие животных [16, 18].
Качество паразитологического анализа при обследовании рептилий зависит от правильного взятия проб, количества исследуемого материала, правильной фиксации, применяемых методов и диагностических тестов, используемых для анализа, а также квалификации специалиста, который занимается идентификацией обнаруженных организмов [19–21]. Существуют различные копрологические методики, которые могут быть использованы с целью выявления паразитов у рептилий, в частности, нативное исследование, микроскопия окрашенных мазков, флотация и техники осаждения [19, 21, 22]. Образцы могут консервироваться различными фиксаторами, которые, в основном, имеют в основе формалин или консерванты, такие как ацетат натрия — уксусная кислота — формалин (SAF) или мертиолят — йод — формальдегид (MIF) [23, 24]. Необходимо отметить, что эти методы были разработаны для людей и домашних животных (то есть, главным образом, млекопитающих). Тогда как фекалии рептилий имеют некоторые отличия от таковых у других групп животных, например, количество, доступное для анализа (часто очень маленькое), и состав кала (присутствие уратов, примесей корма и грунта, если проба берётся из террариума).
Каждый из упомянутых способов анализа для диагностики наличия паразитов у рептилий имеет свои преимущества и недостатки. Нативные нефиксированные фекальные мазки используются для выявления подвижных трофозоитов простейших (жгутиковых, инфузорий и амёб) или других структур с ограниченной плавучестью (специфичные для рептилий яйца цестод, трематод, лярвы нематод), а также тяжёлых яиц нематод, таких как, например, спируриды подсемейства Physalopterinae [21, 25]. Это единственная техника, которая позволяет оценить подвижность трофозоитотов (поскольку они легко разрушаются в растворах вследствие осмотического стресса), но она крайне мало подходит для выявления других паразитов у рептилий и требует при этом очень свежих проб [14, 19, 26]. Капля раствора Люголя делает более чёткими внутренние структуры цист простейших (например, ядра амёб), но также убивает присутствующие трофозоиты [25, 27]. Техники флотации позволяют удалить инородные тела и увеличить концентрацию паразитов всех стадий, чья плотность меньше плотности получаемого раствора (яйца нематод и цестод, а также ооцисты кокцидий). Недостаток этой техники — невозможность выявления тяжёлых фракций, таких как яйца трематод, крупные цисты инфузорий и лярвы нематод [22]. Техники с применением SAF и MIF позволяют законсервировать образцы фекалий на длительный период. Являясь, по сути, техниками осаждения, они — методы выбора для выявления тяжёлых яиц (например, яиц спирурид подсемейства Physalopterinae или яиц сосальщиков, таких как Spirorchis, Styphlodora или Halipegus spp.), которые не обладают достаточной плавучестью в силу высокой относительной плотности. Тем не менее, согласно исследованиям некоторых авторов, они также должны использоваться, в том числе, для идентификации простейших [16, 28] или в качестве комплексного метода для всех групп паразитов рептилий [24, 29]. Ещё один разработанный недавно метод (FLOTAC) был представлен в качестве техники, которая хорошо подходит для выявления простейших у рептилий, но требует специальной аппаратуры.
В настоящем исследовании мы сравнивали технику SAF, которая является стандартной рутинной техникой для исследования проб от рептилий в Гисенском институте паразитологии, и комбинацию нативных мазков, люголевых мазков и флотации в растворах хлорида цинка/хлорида натрия (CNF), которая является стандартным подходом для диагностики желудочно-кишечных паразитов у рептилий, пойманных в дикой природе, в лаборатории IDEXX Vet Med Lab; далее мы определяли преимущества этих техник. Целью исследования не являлось сравнение различных техник, входящих в методику CNF, то есть нативных мазков с использованием физраствора и флотации, на предмет их сравнительной способности выявить яйца нематод и ооцисты кокцидий, обе техники использовались комплементарно. Вопрос, могут ли сходные результаты быть достигнуты для определённых видов рептилий с меньшими временными затратами (если это вообще возможно), например, минуя технику флотации, должен стать целью будущих исследований.
Методы
Образцы
Для сравнения двух различных подходов к диагностике эндопаразитов рептилий были отобраны копрологические пробы от 59 различных рептилий (ящерицы, n = 20; змеи, n = 22; черепахи, n = 17), принадлежащих минимум к 27 различным видам пресмыкающихся из 13 семейств. Критерием для отбора были количество фекалий, достаточное для исследования (примерно 3–4 г), и их приемлемое состояние (не высохшие, не загрязнённые в значительной степени песком или грунтом). Для выявления настолько широкого спектра паразитов у рептилий, насколько возможно, было решено собрать образцы от большого числа рептилий разных видов, включая животных как выращенных в неволе, так и пойманных в дикой природе.
Образцы были получены из числа таковых, поступивших для рутинной диагностики: в лабораторию IDEXX Vet Med Lab (n = 22, группа A, таблица 1); от рептилий, живущих в Мюнхенском центре спасения рептилий (n = 18, группа B, таблица 2); от животных, живущих у различных владельцев в Швейцарии (n = 19, группа C, таблица 3). Образцы группы A были собраны в 2011 году ветврачами из различных Европейских стран (Германия, n = 15; Австрия, n = 4; Франция, n = 2; Дания, n = 1) и были представлены в лабораторию IDEXX Vet Med Lab для рутинного анализа фекалий на наличие эндопаразитов у рептилий (кроме Cryptosporidium spp.). Пробы из группы B были собраны в 2011 году у рептилий (главным образом зелёных питонов, Morelia viridis), которые были незадолго до этого привезены из Индонезии и были задержаны местными властями для надзора с целью выяснить, действительно ли они выведены в неволе, как это декларировалось при импорте. Результаты паразитологического исследования фекалий, подкреплённые иными доказательствами, полученными на основе физических данных и иных лабораторных анализов, позволили сделать заключение, что многие из этих животных были, на самом деле, изъяты их дикой природы [31, 32]. Образцы из группы C были собраны в течение 2011 года непосредственно от живущих у владельцев рептилий в рамках магистерской диссертации, работа над которой проводилась на ветеринарном факультете Бернского университета, при этом были отобраны животные, взятые изначально из дикой природы. Все взятия проб проводились в соответствии с законами о защите животных Германии и Швейцарии и по протоколам, одобренным экспертным советом. Все образцы фекалий были представлены и исследованы с согласия владельцев или местных властей, которые отвечали за надзор над животными.
Паразитологическое исследование
Образцы были исследованы немедленно после доставки в лабораторию IDEXX Vet Med Lab методом нативных и окрашенных раствором Люголя мазков. Половина оставшегося количества проб была затем исследована методом флотации, а другая половина помещена в 12-мл пробирки, заполненные 10 мл раствора SAF и отправлена в Институт паразитологии Гисенского университета им. Юстуса Либиха, Германия.
Комбинированное исследование: мазки/флотация
Нативные мазки, разведённые с физраствором, были приготовлены путём смешивания небольшого количества фекалий с каплей 0,9% раствора NaCl на предметном стекле. При исследовании фекалий рептилий на паразитов необходимо использовать физраствор, поскольку вода может разрушить трофозоиды простейших. Покровное стекло (22×22 мм) помещалось с одной стороны предметного стекла и использовалось для удаления больших частиц примесей и сохранения неизменной суспензии под покровным стеклом. Микроскопическое исследование было проведено на 100- и 400-кратном увеличениях. Окрашенные люголевые мазки готовились аналогичным образом, но вместо физраствора добавлялась капля раствора Люголя. Исследование методом стандартной флотации было проведено по методике Mehlhorn et al. [33]. Раствор для флотации был приготовлен смешиванием 800 мл дистиллированной воды, 210 г NaCl (>99,9%; Roth, Karlsruhe) и 220 г ZnCl2 (>97%; Roth, Karlsruhe), относительная плотность была отрегулирована до 1,3 с помощью ареометра. Все пробы были тщательно гомогенизированы с помощью мешалки в 50-мл пробирках (с плотной крышкой) приблизительно с 15 мл раствора цинка хлорида/натрия хлорида. Суспензия была отфильтрована через фильтр в другую 12-мл центрифужную пробирку, при этом пробирка наполнялась почти полностью, и центрифугировалась в течение 8–10 мин. с центробежным ускорением 300 g. Затем пробирка была аккуратно заполнена флотационным раствором до формирования выпуклого мениска на поверхности. Через 10 мин. покровное стекло аккуратно подносили к мениску до контакта, убирали и размещали на предметном стекле для микроскопического исследования. Покровное стекло исследовалось по принципу меандра при 100-кратном увеличении. Подозрительные структуры, если это было необходимо, дополнительно исследовались при большем увеличении.
Таблица 1. Виды рептилий исследуемой группы A (пробы, доставленные для стандартной диагностики в лабораторию IDEXX Vet Med Lab) и соответствующие результаты, полученные при исследовании двумя методами
–: не обнаружено жгутиковых, инфузорий, амёб, яиц цистод и трематод, лярв нематод
Сокращения обнаруженных паразитов в таблицах 1, 2, 3 (в алфавитном порядке): ACA (яйца типа акантоцефал (скребней)), ANH (яйца Angusticaecum holopterum), ASK (яйца аскарид), BAL (цисты и трофозоиды балантидий), CAR (ооцисты Caryospora), CAP (яйца капиллярид), CAPN (яйца типа Capillaria hepatica, специфичных для грызунов), CEI (ооцисты Choleoeimeria oocysts), CIL (свободно живущие инфузории), DTR (яйца трематод), EIM (ооцисты Eimeria), EIMN (ооцисты Eimeria, специфичных для грызунов), ENEM (яйца/лярвы свободноживущих нематод), ENM (трофозоиты энтеромонад), ENTA (восьмиядерные цисты Entamoeba), ENTV (четырёхъядерные цисты типа Entamoeba invadens), ENTM (цисты Entamoeba muris, специфичных для грызунов), HET (яйца гетеракид), HYN (яйца Hymenolepis nana, специфичных для грызунов), HYD (яйца Hymenolepis diminuta, специфичных для грызунов), ISA (ооцисты Isospora amphiboluri), ISO (ооцисты Isospora), KAPS (скопления яиц Kapsulotaenia), MALO (цисты Malamoeba, специфичных для беспозвоночных), MIL (свободноживущие/продуктовые клещи или их яйца), MYO (специфичные для грызунов, накожные клещи Myocoptes/ Myobia, или их яйца), NYC (цисты/трофозоиты Nyctotherus), OXY (яйца оксиурид), OXYL (лярвы оксиурид), OXYN (яйца специфичных для грызунов оксиурид Aspiculuris/Syphacia), PEN (яйца пентастомид), SAR (спороцисты Sarcocystis), SPI (яйца спирурид), STE (яйца типа стронгилид), STL (лярвы типа стронгилид), STS (яйца Strongyloides), STSL (лярвы Strongyloides), TRC (трофозоиты трихомонад).
Метод SAF
Раствор SAF готовился смешиванием 15 г ацетата натрия (Merck № 1.06265. 1000), 20 мл ледяной уксусной кислоты (Merck № 1.00056. 100), 40 мл формальдегида (37%) и 925 мл водопроводной воды. Законсервированные SAF образцы готовились согласно Bauer [22]. Каждый образец был гомогенизирован в заполненной SAF 12-мл пробирке для фиксации путём тщательного перемешивания и, если необходимо, с использованием аппликаторной палочки. Суспензия была профильтрована через марлю в 12-мл коническую пробирку и центифугирована в течение 1 мин. на 600 g. Надосадочная жидкость удалялась, осадок смешивался с 7 мл 0,9% раствора NaCl и 3 мл этилового эфира (Мерк) и центрифугировался в течение 3 мин. на 600 g. Фекальная пробка с верхней части раствора удалялась с помощью аппликаторной палочки и надосадочная жидкость сливалась вновь. Оставшийся осадок взбалтывался с использованием пастеровской пипетки, затем 1 или 2 капли помещались на предметное стекло и накрывались покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического исследования. Стёкла исследовались полностью на 100-кратном увеличении. При необходимости подозрительные структуры исследовались на большем увеличении, и дополнительно проводился частичный скрининг на увеличении 400 для идентификации кишечных простейших.
Диагностическое исследование каждым отдельным методом проводил один из авторов, имеющий опыт в соответствующей технике. Результаты SAF-анализов были получены после исследования методами нативных мазков и флотации и выводились «вслепую», то есть специалисту не были известны результаты предыдущих исследований. Все виды и стадии развития паразитов, обнаруженные в образцах, документировались. Сюда также относились «псевдопаразиты» (или, лучше, «транзитные формы желудочно-кишечного тракта»), то есть паразитические формы, характерные для других видов животных, не имевших отношения к исследованию. Наличие транзиторных форм характерно для плотоядных рептилий, в желудочно-кишечном тракте которых можно обнаружить эндо- и эктопаразитов, проглоченных с добычей. Тщательная идентификация псевдопаразитов, равно как и свободно живущих организмов, которые попадают в образцы фекалий из внешней среды, представляет непростую задачу для всех специалистов, работающих в данном направлении, и поэтому они были включены нами в спектр возможных результатов. Псевдопаразиты идентифицировались по морфологическим показателям яиц или ооцист согласно Pantchev [25].
Число различных паразитических форм было обычным образом отражено на полуколичественной шкале, но для сравнения двух диагностических методов результаты были переведены в качественную форму, то есть «положительный/отрицательный». Для каждой пробы результаты обоих методов сравнивались, и образцы квалифицировались по одной из следующих категорий: (i) — идентичный результат для обоих методов, (ii) — большее число положительных результатов для метода CNF, (iii) — большее число положительных результатов для метода SAF и (iv) — одинаковое число положительных результатов, но обнаружены различные виды паразитов. Далее методы CNF и SAF были сопоставлены в плане чувствительности для выявления конкретных стадий развития единичного паразита или групп таковых (таб. 4). Результаты были классифицированы следующим образом: a) форма не обнаруживается при исследовании обоими методами; b) форма обнаруживается только методом CNF; c) форма обнаруживается только методом SAF; d) форма обнаруживается обоими методами.
Таблица 2. Виды рептилий исследуемой группы B (пробы, от рептилий, содержавшихся в Мюнхенском центре спасения рептилий) и соответствующие результаты, полученные при исследовании двумя методами
–: не обнаружено жгутиковых, инфузорий, амёб, яиц цестод и трематод, лярв нематод; сокращения обнаруженных паразитов: см. таблицу 1.
Таблица 3. Виды рептилий исследуемой группы C (пробы, собранные непосредственно от рептилий, принадлежащих частным владельцам из Швейцарии) и соответствующие результаты, полученные при исследовании двумя методами
–: не обнаружено жгутиковых, инфузорий, амёб, яиц цистод и трематод, лярв нематод; сокращения обнаруженных паразитов: см. таблицу 1.
Таблица 4. Различия в обнаружении отдельных паразитических форм у рептилий методами CNF и SAF
Взаимосвязь между числом паразитов у рептилий, выявленных каждым методом, выявлялась «Точным тестом Фишера», а крайняя однородность проверялась методом МакНемара.
1 Яйца форм, характерных для стронгилид, аскарид, спирурид, стронгилоид и Capillaria.
2 Лярвы, яйца трематод, амёбы, инфузории.
3 Точный тест Фишера не применим.
Статистический анализ
Статистическое сравнение двух диагностических техник проводилось при помощи программы BiAS [34]. На первом этапе было сделано определение частотности обоих техник для изучаемых образцов в целом по методу МакНемара. Для каждого конкретного образца анализировалась статистическая связь двух техник с использованием точного теста Фишера. Для паразитических форм было проведено последующее сравнение по методу МакНемара для крайней однородности по Эверитту с нулевой гипотезой, предполагающей отсутствие различий частотности анализа между двумя методами. Различия в чувствительности рассматривались как значимые при уровне P < 0,05.
Результаты
Анализируемые образцы фекалий рептилий содержали широкий спектр паразитов, включая различные виды нематод (55,9%, n = 33), трематод (15,3%, n = 9), пентастомид (3,4%, n = 2) и простейших (47,5%, n = 28). Индивидуальные результаты паразитологических исследований показаны в таблицах 1, 2 и 3. Доля «истинных» паразитов (то есть, не учитывая псевдопаразитов) в целом составила 93,2%. Псевдопаразиты, выявленные в данном исследовании, главным образом, включали паразитические формы, специфичные для грызунов и проходящие через ЖКТ рептилий транзитом, а именно ооцисты кокцидий (Eimeria spp., рис. 3), яйца оксиурид (Aspiculuris/Syphacia), яйца капиллярид (типа Capillaria hepatica), яйца ленточных червей (Hymenolepis nana/H. diminuta), накожных клещей или их яйца (родов Myocoptes/Myobia, илл. 3), а также цисты амёб с восемью ядрами (типа Entamoeba muris, илл. 1). Кроме этого были обнаружены свободно живущие организмы (формы нематод или простейших, а именно, инфузории), попавшие в образцы после контакта с грунтом или водой, а также корм и бытовые клещи (и их яйца). Сочетанная инвазия двух или более паразитов у рептилий выявлена в 64,4% образцов, и животные, изъятые из дикой природы, содержали паразитические формы, отличные от таковых, выявленных у выведенных в неволе, включая два вида неидентифицированных яиц из фекалий зелёного питона (Morelia viridis; илл. 3).
  |
|
Илл. 1. Различные формы паразитов из фекалий сухопутных черепах (за исключением D2), выявленные как CNF (слева), так и SAF-техникой (справа): A1) яйцо аскариды (Angusticaecum holopterum) (слева) и два яйца оксиурид (в середине, справа), обнаруженные методом флотации; A2) яйцо и лярва оксиуриды; B1) циста жгутикового (Nyctotherus spp.), обнаруженная в нативном мазке; B2) трофозоит Nyctotherus spp. (слева) и яйцо аскариды с эмбрионом (Angusticaecum holopterum справа); C1) циста жгутикового (Balantidium spp.) при исследовании в нативном мазке; C2) трофозоид Balantidium spp.; D1) циста Entamoeba spp. (восемь ядер; характерная для E. invadens) при исследовании в окрашенном раствором Люголя мазке; D2) циста Entamoeba spp. (восемь ядер; характерная для E. invadens) из фекалий змеи (вид не уточняется) |
Разница результатов, полученная двумя диагностическими методами, равнялась 88,1% (n = 52, 95%, доверительный интервал [ДИ] = 77,1 — 95,1%) от всех исследованных образцов, в 7 случаях (11,9%) оба метода показали идентичные результаты. В 32 образцах (54,2%) комбинация методов нативных мазков с физраствором и флотации обнаруживала более широкий спектр паразитов у рептилий, чем метод SAF, и, напротив, в 8 образцах (13,6%) метод SAF был более результативен. Для 12 образцов результат был неопределённым, поскольку было обнаружено одинаковое количество паразитов, но результаты не были идентичными. Метод МакНемара для парных наблюдений показал высокую значимость различий частоты анализа между двумя методами в целом (P < 0,0001). Кроме того, имела место значимая несогласованность при обнаружении видов паразитических форм, как показывает метод МакНемара для крайней однородности, что позволяет считать, что крайние возможности каждого метода должны быть одинаковы. Связь между двумя методами и различия в определении видов паразитических форм показана в таблице 4. Для некоторых паразитов, таких как пентастомиды и спируриды, количество позитивных результатов было слишком мало, чтобы сделать статистически значимое сравнение.
  |
| Илл. 2. Различные формы паразитов из фекалий ящериц (за исключением D1-2), выявленные как CNF (слева), так и SAF-техникой (справа): A1) яйцо оксиуриды, обнаруженное методом флотации в фекалиях бородатой агамы (Pogona viticeps); A2) яйцо оксиуриды (слева) и яйцо пентастомиды, обнаруженное в образце фекалий геккона Брука (Hemidactylus brookii); B1) ооцисты Choleoeimeria spp., обнаруженные методом флотации в фекалиях хамелеона Джексона (Triocerus jacksonii); B2) ооцисты Choleoeimeria baltrocki, обнаруженные в фекалиях длинноногого сцинка (Eumeces schneideris); C1) яйцо спируриды (Physalopterinae), обнаруженное методом нативного мазка в фекалиях зелёного варана (Varanus prasinus); C2) яйцо спируриды (Physalopterinae), обнаруженное в фекалиях зелёного варана (Varanus prasinus); D1) яйца с эмбрионами типа Strongyloides (вверху) и типа стронгилид (типа Kalicephalus-/Herpetostrongylus; внизу), обнаруженные в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis); D2) инвазивная третья стадия лярвы Strongyloides spp. (обратить внимание на зазубренный кончик хвоста), обнаруженная в фекалиях Boa constrictor |
Для отдельно взятых образцов наиболее явные различия в диагностике методами CNF и SAF были выявлены для форм простейших паразитов у рептилий. SAF не обнаруживал жгутиковых, тогда как CNF обнаружил 15 позитивных проб. Большинство жгутиковых, обнаруженных при CNF в нативных мазках с физраствором, на основе внешнего вида и характера движения были идентифицированы как трихомонады (табл. 1, 2 и 3). Ооцисты кокцидий присутствовали в 17 образцах; в 5 случаях они были выявлены обоими методами, но в 10 случаях — только методом CNF, а в двух образцах — только методом SAF (статистически значимое различие с P = 0,04). Второе по значимости различие между двумя методами выявлено при идентификации яиц нематод. Были обнаружены яйца нематод всех разновидностей, помимо оксиурид найдены яйца стронгилид, аскарид, спирурид, строгилоид и капиллярий. Хотя большинство позитивных результатов выявлено обоими методами (n = 17), только в одном случае анализ был положительным исключительно при диагностике SAF-методом, тогда как способом CNF найдено 9 положительных результатов, не обнаруженных SAF. Это преимущество CNF получено, главным образом, за счёт лучшего выявления яиц оксиурид по сравнению с SAF. С другой стороны, паразитические формы с высокой плотностью значительно чаще обнаруживались при SAF (P = 0,03). Это также наблюдалось для яиц трематод, но этот результат не являлся статистически значимым (P = 0,13).
  |
| Илл. 3. Различные формы паразитов из фекалий змей, выявленные как CNF (слева), так и SAF-техникой (справа): A1) спороцисты Sarcocystis spp. и яйца трематод (в центре), обнаруженные методом нативных мазков в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis); A2) спороцисты Sarcocystis spp., яйцо трематоды (вверху) и яйцо стронгилиды (типа Kalicephalus-/Herpetostrongylus-like; внизу), обнаруженные в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis); B1) характерное скопление яиц (Kapsulotaenia spp.), обнаруженное методом нативного мазка в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis); B2) характерное скопление яиц (Kapsulotaenia spp.), обнаруженное в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis); C1) ооциста Eimeria spp. (специфичный для грызунов «псевдопаразит», проходящий через ЖКТ рептилий транзитом; вверху) и яйцо Capillaria (синоним — Ophidiocapillaria) spp., обнаруженные методом флотации у зелёного питона (Morelia viridis); C2) ооциста Eimeria spp. (специфичный для грызунов «псевдопаразит», проходящий через ЖКТ рептилий транзитом; внизу) и яйцо Capillaria (синоним — Ophidiocapillaria) spp., обнаруженные в фекалиях королевского питона (Python regius); D1) Три яйца гетеракид (слева) и яйцо клеща (типа Myocoptes-musculinus; в центре; яйцо накожного клеща, специфичного для грызунов, проходящее транзитом через ЖКТ рептилий), обнаруженное методом флотации в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis); D2) неидентифицированное яйцо, подобное яйцам Acanthocephala spp., обнаруженное в фекалиях зелёного питона (Morelia viridis) |
Обсуждение
Паразиты у рептилий, содержащихся в неволе, например, в зоопарках, на фермах или в качестве домашних животных, являются одними из наиболее часто встречающихся выявляемых возбудителей заболеваний и могут достаточно серьёзно и пагубно воздействовать на состояние животных [16, 18]. Таким образом, должная диагностика является важной задачей. Был разработан ряд процедур для диагностики различных форм паразитов в копрологическом материале, при этом одни из них являются методами широкого спектра применения, а другие — специализированными техниками, используемыми только для определённых типов паразитов у рептилий. Хотя техника SAF рассматривалась рядом авторов как «всеобъемлющая», такое определение относится, главным образом, к диагностике у людей [24, 29]. SAF-метод успешно применяется для выявления паразитов у людей в течение десятилетий и был за это время предметом нескольких исследований, однако за всё это время сравнений с другими техниками диагностики фекалий у рептилий не проводилось. Решением для преодоления ограничений, свойственных отдельным методам, является применение разных техник для одной пробы; наиболее частой комбинацией является сочетание методов флотации и нативных фекальных мазков. Когда диагностика выполняется опытным специалистом, оба метода являются одинаково трудозатратными, хотя в отношении разных проб этот показатель может различаться. В данном исследовании мы сравнивали технику SAF с комбинацией нативных мазков с физраствором, люголевых мазков свежих фекалий и флотации с раствором хлорида цинка/хлорида натрия.
Оба метода показали высокую степень различий в спектре выявленных результатов, при этом комбинация нативных мазков и флотации выявила значимо большее число форм паразитов у рептилий. Первая причина таких различий — более высокая чувствительность метода CNF для выявления форм простейших, главным образом, кокцидий ооцист (илл. 2) и трофозоитов жгутиковых, в первую очередь, трихомонад (таб. 4). В то время как ооцисты могут легко концентрироваться для анализа методом флотации, главное преимущество метода нативных мазков с физраствором — то, что активные простейшие могут быть без труда выявлены при наблюдении движения амёб, жгутиковых и инфузорий [14, 19, 25]. Ограничением является тот факт, что для анализа используется очень мало материала, и невозможно судить о концентрации. Кроме того, поскольку движение является принципиальной характеристикой, которая позволяет идентифицировать трофозоиты в ходе данной процедуры, если слой фекалий в мазке слишком толстый, проблематично увидеть маленьких, бесцветных простейших, которые двигаются в поле зрения.
В настоящем исследовании паразитов у рептилий не было найдено жгутиковых методом SAF, даже не смотря на то, что небольшое количество проб, показавших положительный результат при исследовании методом нативных мазков, были перепроверены, чтобы исключить ложноположительный результат, полученный из-за субъективной интерпретации. Причина этому остаётся неясной. В то время как часть авторов рекомендуют SAF как специфическую технику для выявления простейших у рептилий [14, 16], другие ссылаются на неудачные результаты, полученные в результате применения этого метода [23, 36]. При разработке техники MIF (являющейся предшествующей методу SAF), Sapero и Lawless [23] сообщали о большом числе неудач с идентификацией жгутиковых паразитов у рептилий, которые теряли способность двигаться или не были идентифицированы. Pietrzak-Johnston et al. [36] писали о том, что пробы, консервированные SAF, плохо выявляли амёб ввиду слабой консервации. В мазках, приготовленных из этих образцов и окрашенных железистым гематоксилином, организмы не могли быть легко обнаружены. С другой стороны, ряд авторов находили консервацию фекалий с последующей окраской более эффективной, по сравнению с исследованием влажных мазков, для выявления трофозоитов [28, 29]. По нашему опыту работы в лаборатории Института паразитологии (Гиссенского университета, Германия), в копрологических пробах от мышей, содержащих жгутиковых, эти паразиты выявляются легко. Наиболее обычными у мышей являются трихомонады, например, Tritrichomonas muris. Возможно, что эти виды, хотя и обладают нежными жгутиками и ундулирующими мембранами, имеют большую прочность клеток и лучшие фиксационные качества, чем виды, обнаруживаемые в пищеварительном тракте рептилий.
Для обнаружения трофозоитов простейших фекалии должны быть исследованы настолько быстро, насколько возможно, или же зафиксированы сразу после взятия [19, 24, 37]. Выполнить это требование полностью не представлялось возможным, так как определённое время уходило на доставку образцов в лабораторию. Хотя жгутиковые паразиты у рептилий всё же могли быть обнаружены в разных случаях в жидких мазках, время между отбором проб и фиксацией SAF могло быть слишком большим, что привело к предварительному повреждению образцов. Кроме того, образцы в данном исследовании, которые фиксировались SAF, сохранялись больше года до проведения микроскопического исследования, и, возможно, этот период был слишком большим. С другой стороны, раствор SAF, в отличие от фиксатора MIF, несомненно, является стабильным и, таким образом, хорошо подходит для консервации образцов, которые необходимо сохранять в течение длительного периода [24]. Образцы для диагностики, приготовленные с SAF, показывают стабильность долгое время. В исследованиях не отмечалось исчезновения организмов или ухудшения качества образцов спустя шесть месяцев после фиксации [23, 38]. В сравнении, проводимом европейскими референтными лабораториями, микроскопическая диагностика образцов фекалий, фиксированных SAF, для обнаружения гельминтов и кишечных простейших паразитов у рептилий проводилась через 12 месяцев после взятия проб [39]. Авторы с удивлением обнаружили большой разброс результатов, полученных разными лабораториями, исследовавшими одни и те же образцы фекалий, фиксированных SAF, при отсутствии каких-либо затруднений в результате длительного периода, прошедшего между взятием образцов и исследованием. При повторных тестах вновь было очень мало общего между результатами различных центров при обнаружении патогенных кишечных простейших, в то время как распространённые виды гельминтов были достоверно диагностированы участвовавшими в исследовании лабораториями. В последнее время авторы подняли вопрос, может ли время хранения оказать влияние на результаты анализа, но констатировали, что образцы, фиксированные SAF для учебных целей, сохраняются неизменными в течение многих лет [40].
Также негативное влияние может оказывать тот факт, что ферментная активность по-прежнему сохраняется в образцах, консервированных SAF [41]. Также, согласно ряду авторов, использование эфира для обработки образцов выглядит спорным. Faust et al. [27] обнаружили, что под воздействием эфира количество цист простейших уменьшается, что не позволяет поставить диагноз должным образом. Glinz et al. [42] выявили, что значительная часть яиц анкилостом разрушались в образцах, сохранявшихся SAF в течение 83 дней. Также значительно большее количество яиц анкилостом обнаруживалось в образцах фекалий, сохранённых SAF без добавления эфира, тогда как после обработки образцов эфиром можно было наблюдать разрушенные яйца. В нашем исследовании можно было видеть, что у некоторых яиц типа стронгилид или цист амёб наблюдались повреждённые оболочки в сочетании с общим очень маленьким их количеством. Напротив, яйца аскарид могут сохранять жизнеспособность в 10% растворе формалина в течение 8 месяцев [43]. По этой причине обычным является обнаружение яиц с зародышами при исследовании долго хранившихся образцов, фиксированных SAF. Аспект негативного влияния на нежные клетки амёб фиксаторов и других химикалий, таких как эфир, безусловно, остаётся предметом будущих исследований.
Второй причиной лучшей общей результативности CNF явилась высокая чувствительность метода к выявлению яиц нематод, в первую очередь — оксиурид (табл. 4, илл. 1 и 2). Несомненно, флотация представляет больше возможностей для концентрирования яиц этого типа, нежели техника осаждения. Метод SAF имел бы большую результативность, если исследовался бы весь осадок, как рекомендуют некоторые авторы [40], но это не представляется возможным ввиду чрезмерных временных затрат. За исключением случаев, когда необходимо сохранить осадок для длительного хранения (например, для повторного исследования), дополнительно необходимо делать флотацию оставшегося осадка для преодоления этого ограничения.
С другой стороны, если говорить об идентификации стронгилид в настоящем исследовании, методом SAF они обнаруживались в большем количестве образцов (главным образом, благодаря лучшему обнаружению личиночных форм), но это преобладание не было статистически достоверным. SAF также показывал преимущество в обнаружении яиц трематод, хотя различие также не было статистически достоверным (p = 0,13). Все положительные образцы, выявленные методом CNF, были диагностированы только благодаря анализу нативных мазков как части данного комбинированного метода. Это не стало неожиданностью, поскольку яйца трематод обладают высокой плотностью [22, 44]. Главным образом, при исследовании «тяжёлых» форм паразитов у рептилий (то есть обладающих высокой плотностью, таких как лярвы, яйца трематод, амёбы, инфузории), SAF показывал значимые преимущества по сравнению с CNF. Этого можно было ожидать, поскольку эти формы не концентрируются методом флотации, поэтому их обнаружение затруднено при исследовании нативных мазков, где они могут быть утеряны, оставаясь в концентрированной части, не попавшей в готовый образец для исследования.
У рептилий, содержащихся в неволе, преобладают определённые инвазии нематод, таких как оксиуриды, стронгилиды, Strongyloides/Capillaria spp. и, до некоторой степени, гетеракиды и аскариды (у черепах и хамелеонов) [20]. Наличие этих паразитов у рептилий может приводить к серьёзным проблемам со здоровьем у животных-хозяев. Трематодам для развития требуется наличие одного или нескольких промежуточных хозяев, в первую очередь, моллюсков. В террариумах этот цикл, как правило, прерывается, поэтому в норме содержащиеся в неволе животные не инвазируются повторно. [20, 25, 31, 32]. В связи с этим представляется более целесообразным обследовать таких животных методом CNF, нежели SAF. Напротив, для обследования диких животных и особей, которые недавно были введены в коллекции из природы, необходимо дополнительное исследование методами, основанными на принципе осаждения, такими, как SAF.
Кроме того, выявление у рептилий паразитов со сложным жизненным циклом может являться доказательством того, что животное взято из дикой природы [45]. Ежегодно в Европу импортируются большое количество животных, и часто государственные служащие находятся в затруднении, пытаясь выяснить, были ли эти животные действительно выведены в неволе, как написано в документах, разрешающих импорт, или же изъяты из дикой природы [31, 32]. Один пойманный в природе зелёный питон (Morelia viridis) был среди животных, вовлечённых в данное исследование, и являлся носителем Kapsulotaenia spp. Характерные пакеты яиц этих цестод могут быть диагностированы обоими методами, но выявляются в весьма небольших количествах при исследовании образцов, фиксированных SAF, что делает диагностику более затруднительной (см. илл. 3). Причины могут быть те же, что обсуждались в связи с диагностикой простейших, но также это может быть связано с тем, что SAF-метод обычно требует более серьёзного опыта со стороны исследователя.
В фекалиях другого пойманного в природе зелёного питона методом SAF были найдены два яйца, которые не были точно идентифицированы. Размер и форма имели некоторое сходство с яйцами скребней (илл. 1), обнаруженных у варана (Varanus sp.) [18]. Известно только небольшое количество видов рептилий, у которых могут паразитировать скребни, и до настоящего времени не описано паразитирования представителей этого типа у зелёных питонов. Животное, у которого был взят образец для настоящего исследования, было поймано в дикой природе и импортировано в Германию из Индонезии. В Индо-Австралийском регионе ранее обнаруживались представители рода Sphaerechinorhynchus у чёрных аспидов (род Pseudechis, Австралия), азиатской кобры Naja naja (Северный Борнео) и у королевской кобры (Ophiophagus hannah, Южная Азия, район точно неизвестен) [46, 47]. Тем не менее, нельзя исключать, что эти яйца, даже если они на самом деле принадлежат скребням, не являются специфическими паразитами для зелёных питонов. Акантоцефалы часто паразитируют у птиц, в результате чего эти яйца могут являться только псевдопаразитической формой, о чём должен быть осведомлён специалист, проводящий диагностику.
Выводы
При диагностике паразитов пищеварительного тракта рептилий метод SAF показывает значимые различия по сравнению с исследованием нативных мазков с физраствором, мазков, окрашенных раствором Люголя, и исследования методом флотации с хлоридом цинка/хлоридом натрия (CNF). Преимущества метода CNF заключаются, главным образом, в лучшей способности выявлять формы простейших и яйца нематод, тогда как яйца трематод лучше диагностируются методом SAF. Таким образом, CNF является рекомендованным методом для рутинного исследования фекалий от животных, которые содержатся в неволе, тогда как SAF рекомендуется в качестве дополнительного метода для животных, пойманных в дикой природе и особей, недавно введённых в коллекцию. Также SAF остаётся методом выбора в случаях, когда пробы не могут быть исследованы немедленно или требуется повторное исследование образцов и, соответственно, их фиксация. Добавочный этап флотации остаточного осадка может, вероятно, быть необходимой мерой для повышения чувствительности этого метода. Образцы необходимо исследовать настолько быстро, насколько возможно, поскольку нельзя исключать разрушение ряда форм паразитов у рептилий после длительного промежутка времени.
Литература
1. Arena PC, Steedman C, Warwick C: Amphibian and reptile pet markets in the EU: An investigation and Assessment. Animal public e.V, Dusseldorf. [http://animal-public.de/wp-content/uploads/2012/04/ARPM2012_v131.pdf]
2. Karesh WB, Cook RA, Bennett EL, Newcomb J: Wildlife trade and global disease emergence. Emerg Infect Dis 2005,11:1000–1002.
3. Tappe D, Meyer M, Oesterlein A, Jaye A, Frosch M, Schoen C: Transmission of Armilliferarmillatus ova at snake farm, The Gambia, West Africa. Emerg Infect Dis 2011, 2:251–254.
4. Pantchev N, Tappe D: Pentastomiasis and other parasitic zoonoses from reptiles and amphibians. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 2011, 124:528–535.
5. Tappe D, Buttner DW: Diagnosis of human visceral pentastomiasis. PLoS Negl Trop Dis 2009, 3:e320.
6. Foldenauer U, Pantchev N, Simova-Curd S, Martin Jurado O, Hatt JM: Pentastomidenbefallbei Abgottschlangen (Boa constrictor) — Diagnostik und endoskopische Parasitenentfernung. Tierarztl Pr K 2008, 36:443–449.
7. Beaver PC, Rolon FA: Proliferating larval cestode in man in Paraguay. A case report and review. Am J Tropical Med Hyg 1981, 30:625–637.
8. Chang KH, Chi JG, Cho SY, Han MH, Han DH, Han MC: Cerebralsparganosis: analysis of 34 cases with emphasis on CT features. Neuroradiol 1992, 34:1–8.
9. Gong C, Liao W, Chineah A, Wang X, Hou BL: Cerebral sparganosis in children: epidemiological, clinical and MR imaging characteristics. BMC Pediatr 2012, 12:155.
10. Horchner F: Zur Parasitenfauna der Chameleontidae und Agamidae. Z f Parasitenkunde 1963, 22:537–544.
11. Kutzer E, Grunberg W: Parasitologie und Pathologie der Spulwurmkrankheit der Schlangen. Zentralblattfur Veterinarmedizin Reihe B 1965, 12(Suppl 2):155–175.
12. Mihalca AD, Gherman C, Ghira I, Cozma V: Helminth parasites of reptiles (Reptilia) in Romania. Parasitol Res 2007, 101:491–492.
13. Radhakrishnan S, Kurup SP, Banerjee PS: Endoparasitism in Captive Wild-Caught Snakes Indigenous to Kerala. India Zoo Biol 2009, 28:253–258.
14. Scullion FT, Scullion MG: Gastrointestinalprotozoal diseases in reptiles. J Exot Pet Med 2009, 18:266–278.
15. Papini R, Manetti C, Mancianti F: Coprological survey in pet reptiles in Italy. Vet Rec 2011,169:207.
16. Rataj AV, Lindtner-Knific R, Vlahovic K, Mavri U, Dove A: Parasites in pet reptiles. Acta Vet Scand 2011, 53:33.
17. Hedley J, Eatwell K, Shaw DJ: Gastrointestinal parasitic burdens in UK tortoises: a survey of tortoise owners and potential risk factors. Vet Rec 2013, 173:525.
18. Greiner EC, Mader DR: Parasitology. In Reptile Medicine and Surgery. 2nd edition. Edited by Mader DR. St.Louis: Saunders Elsevier; 2006:343–364.
19. Barnard SM, Upton SJ: Laboratory Procedures for the Herpetoculturist. In A Veterinary Guide to the Parasites of Reptiles, Volume 1. Malabar: Krieger Publishing; 1994:81–98.
20. Pasmans F, Blahak S, Martel A, Pantchev N: Introducing reptiles into a captive collection: the role of the veterinarian. Vet J 2008,175:53–68.
21. Zajac AM, Conboy GA: Fecal Examination for the Diagnosis of Parasitism. In Veterinary Clinical Parasitology. 8th edition. Chichester: Wiley-Blackwell; 2012:3–164.
22. Bauer C: Untersuchungsmethoden. In Veterinarmedizinische Parasitologie. 6th edition. Edited by Schnieder T. Berlin: Paul Parey; 2006:84–104.
23. Sapero JJ, Lawles DK: The MIF stain-preservation technic for the identification of intestinal protozoa. Am J Trop Med Hyg 1953, 2:613–619.
24. Yang J, Scholten T: A fixative for intestinal parasites permitting the use of concentration and permanent staining procedures. Am J Clin Pathol 1977, 67:300–304.
25. Pantchev N: Parasitosen bei Reptilien. In Praktische Parasitologie bei Heimtieren. 2nd edition. Hannover: Schlutersche; 2012:238–341.
26. Cebra CK, Stang BV: Comparison of methods to detect gastrointestinal parasites in llamas and alpacas. J Am Vet Med Assoc 2008, 232:733–741.
27. Faust EC, Sawitz W, Tobie J, Odom V, Peres C, Lincicome DR: Comparative efficiency of various technics for the diagnosis of protozoa and helminths in feces. J Parasitol 1938, 25:241 -261.
28. Mank TG, Zaat JO, Blotkamp J, Polderman AM: Comparison of fresh versus sodium acetate acetic acid formalin preserved stool specimens for diagnosis of intestinal protozoal infections. Eur J ClinMicrobiol Infect Dis 1995, 14:1076–1081.
29. Shetty N, Prabhu T: Evaluation of faecal preservation and staining methods in the diagnosis of acute amoebiasis and giardiasis. J Clin Pathol 1988, 41:694–699.
30. Rinaldi L, Mihalca AD, Cirillo R, Maurelli MP, Montesano M, Capasso M, Cringoli G: FLOTAC can detect parasitic and pseudoparasitic elements in reptiles. Exp Parasitol 2012,130:282–284.
31. More G, Pantchev N, Herrmann DC, Globokar Vrhovec M, Ofner S, Conraths FJ, Schares G: Molecular identification of Sarcocystis spp. helped to define the origin of green pythons (Morelia viridis) confiscated in Germany. Parasitology 2013, 5:1–6.
32. Offner S, Baur M, Blahak S, Friz T, Turbl T, Pantchev N, Hofmann RW: Possibilities to differentiate wild born from captive bred reptiles. In Proceedings International Conference on Reptile and Amphibian Medicine: 13–15 May 2012; Cremona. Edited by Biron K, Bedin M, Blahak S, Kempf H, Knotek Z, Nardini S, Schilliger L, Selleri P. 2012:94–96.
33. Mehlhorn H, Duwel D, Raether W: Untersuchungsmethoden. In Diagnose und Therapie der Parasitosen von Haus- Nutz- und Heimtieren. 2nd edition. Stuttgart Jena New York: Gustav Fischer Verlag; 1993:1–21.
34. Ackermann H: BiAS fur Windows, Biometrische Analyse von Stichproben, Version 9.08. Hochheim Darmstadt: Epsilon-Verlag; 2010.
35. Pantchev N, Nedorost N, Alexandrow N, Altherr B, Globokar Vrhovec M, Grum C, Richter B: Molekulare Differenzierung von Flagellaten (ein vom Ingo-und-Waltraud-Pauler-Fonds der AG ARK unterstutztes Projekt) und erste praktische Umsetzung mit Schwerpunkt auf Echsen und Schlangen. In Tagungsband der 39. Arbeitstagung der AG ARK (AG der DGHT), Fortbildungsveranstaltung fur Tierarzte: 13–14 April 2013. Edited by Offner S, Weinzierl F. Deutsche Nationalbibliothek, Hamburg: AGARK/DGHT; 2013:51–66.
36. Pietrzak-Johnston SM, Bishop H, Wahlquist S, Moura H, Da Silva ND, Da Silva SP, Nguyen-Dinh P: Evaluation of commercially available preservatives for laboratory detection of helminths and protozoa in human fecal specimens. J Clin Microbiol 2000, 38:1959–1964.
37. Marti H, Escher E: SAF-an alternative fixation solution for parasitological stool specimens. Schweiz med Wschr 1990, 120:1473–1476.
38. Libman MD, Gyorkos TW, Kokoskin E, Maclean JD: Detection of pathogenic protozoa in the diagnostic laboratory: result reproducibility, specimen pooling, and competency assessment. J ClinMicrobiol 2008, 46:2200–2205.
39. Bogoch II, Raso G, N'Goran EK, Marti HP, Utzinger J: Differences in microscopic diagnosis of helminths and intestinal protozoa among diagnostic centres. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2006, 25:344–347.
40. Utzinger J, Botero-Kleiven S, Castelli F, Chiodini PL, Edwards H, Kohler N, Gulletta M, Lebbad M, Manser M, Matthys B, N'Goran EK, Tannich E, Vounatsou P, Marti H: Microscopic diagnosis of sodium acetate-acetic acid-formalin-fixed stool samples for helminths and intestinal protozoa: a comparison among European reference laboratories. ClinMicrobiol Infect 16:267–273.
41. Troll H, Marti H, Weiss N: Simple differential detection of Entamoebahistolytica and Entamoebadispar in fresh stool specimens by sodium acetate-acetic acid-formalin concentration and PCR. J Clin Microbiol 1997, 35:1701–1705.
42. Glinz D, Silue KD, Knopp S, Lohourignon LK, Yao KP, Steinmann P, Rinaldi L, Cringoli G, N'Goran EK, Utzinger J: Comparing diagnostic accuracy of Kato-Katz, Koga agar plate, ether-concentration, and FLOTAC for Schistosomamansoni and soil-transmitted helminths. PLoS Negl Trop Dis 2010 4:e754.
43. Enigk K: Resistance of the infectious forms of endoparasites of domestic animals. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 1979, 92:491–497.
44. Harnnoi T, Wijit A, Morakote N, Pipitgool V, Maleewong W: Specific gravity of Opisthorchisviverrini eggs. J Helminthol 1998, 72:359–361.
45. Adams AA: Establishing jurisdiction through forensic parasitology. J Parasitol 1993, 79:459–460.
46. Schmidt GD, Kuntz RE: Sphaerechinorhynchusserpenticola sp. n. (Acanthocephala: Sphaerechinorhynchinae), a parasite of the asian cobra, Najanaja (Cantor), in Borneo (Malaysia). J Parasitol 1966, 52:913–916.
47. Bolette DP: Sphaerechinorhynchusophiograndis n. sp. (Acanthocephala: Plagiorhynchidae: Sphaerechinorhynchinae), described from the intestine of a king cobra, Ophiophagushannah. J Parasitol 1997, 83:272–275.
Источник: Acta Veterinaria Scandinavica 2014, 56:44. Licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly credited. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated.
СВМ № 3/2016