→ Микологические исследования в ветеринарной диагностике

Краткая характеристика

Микологическое исследование — совокупность лабораторных методов, направленных на выявление, выделение и видовую идентификацию микроскопических грибов (микромицетов) в патологическом материале, полученном от животного, а также на определение чувствительности выделенных возбудителей к противогрибковым препаратам. В ветеринарной медицине грибы вызывают как поверхностные поражения кожи и её производных, так и глубокие, системные инфекционные процессы, а также могут служить причиной микотоксикозов при контаминации кормов. Поскольку клиническая картина многих грибковых заболеваний неспецифична и пересекается с проявлениями бактериальных, паразитарных и иммуноопосредованных дерматозов, именно лабораторная микология во многих случаях играет решающую роль в установлении окончательного диагноза.

Микологическое исследование не является единичным методом, а представляет собой многоэтапный алгоритм, включающий прямую микроскопию, культуральное выделение, идентификацию культур и, при необходимости, молекулярно-генетическое подтверждение.

Прямое микроскопическое исследование проводят с использованием нативных препаратов патологического материала (волос, чешуек, корочек, соскобов, экссудата, мазков). Для просветления плотного материала применяют раствор гидроксида калия или натрия; для сохранения морфологии структур гриба — лактофенол. Препараты культур окрашивают лактофеноловым синим (lactophenol cotton blue), что улучшает визуализацию макроконидий и гиф; дрожжевые клетки дополнительно окрашивают по Граму.

Культуральное исследование основано на посеве материала на питательные среды: агар Сабуро с глюкозой, агар Чапека, дерматофит-тест-среду (dermatophyte test medium, DTM), агар Литмана. Дерматофиты культивируют при комнатной температуре до трёх-четырёх недель, дрожжи — при 37 °C в течение нескольких суток. Идентификацию выполняют по морфологии колоний и микроскопической картине (макроконидии, микроконидии, хламидоспоры, артроспоры), а для дрожжей — биохимическим методом. В современных лабораториях широко применяют времяпролётную масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS), позволяющую идентифицировать грибы по белковому спектру за несколько минут. Молекулярное подтверждение осуществляют полимеразной цепной реакцией с секвенированием внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рибосомальной ДНК.

Определение чувствительности выделенных грибов к антимикотикам выполняют методом E-тестов или диско-диффузионным методом в соответствии со стандартами Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI).

Для чего используется метод

Микологическое исследование применяют для подтверждения или исключения грибковой этиологии заболевания, установления видовой принадлежности возбудителя, выбора и коррекции противогрибковой терапии на основании определения чувствительности, а также для контроля излеченности (микологического выздоровления) — например, получения отрицательных результатов посева или полимеразной цепной реакции после завершения лечения дерматофитии. Отдельное направление — исследование кормов и объектов окружающей среды на контаминацию токсигенными грибами при диагностике микотоксикозов и для контроля санитарного состояния помещений. Кроме того, метод используется в эпидемиологическом мониторинге и при расследовании зооантропонозов, поскольку дерматофитии и ряд других микозов передаются от животных человеку.

Какие патологии можно выявить этим методом

Микологическое исследование позволяет диагностировать дерматофитию (возбудители родов Microsporum и Trichophyton), в том числе микроспорию, трихофитию и фавус; кандидоз (кандидамикоз), вызываемый грибами рода Candida, в первую очередь Candida albicans; малассезиозный дерматит и наружный отит, обусловленные дрожжами рода Malassezia, прежде всего Malassezia pachydermatis; аспергиллёз (преимущественно Aspergillus fumigatus); криптококкоз; споротрихоз; эпизоотический лимфангоит; а также глубокие и диссеминированные микозы — бластомикоз, гистоплазмоз, кокцидиоидомикоз. Метод применяют и при актиномикозе и псевдоактиномикозе (актинобациллёзе). При исследовании кормов выявляют токсигенные плесневые грибы родов Aspergillus, Fusarium, Stachybotrys, Claviceps и другие, ответственные за микотоксикозы сельскохозяйственных животных.

Преимущества и недостатки метода

К преимуществам микологического исследования относят: возможность выделения возбудителя в чистую культуру с установлением видовой принадлежности, что недоступно большинству косвенных методов; возможность определения чувствительности к антимикотикам и, соответственно, обоснованного выбора терапии; относительную дешевизну и доступность классических методов; неинвазивность забора материала. Прямая микроскопия волос и чешуек при дерматофитии подтверждает инфекцию более чем в 85% случаев и даёт быстрый предварительный результат.

К недостаткам относят: длительность исследования — выделение и идентификация дерматофитов занимают от десяти дней до месяца; зависимость результата от качества забора и транспортировки материала; риск контаминации посевов сапрофитной микрофлорой; необходимость высокой квалификации специалиста для морфологической идентификации плесневых грибов. Существенное ограничение — трудность клинической интерпретации при выделении грибов-комменсалов (Malassezia, Candida), которые в норме присутствуют на коже и слизистых оболочках, из-за чего положительный результат посева не всегда равнозначен этиологической роли возбудителя. Полимеразная цепная реакция не различает жизнеспособные и погибшие споры, что ограничивает её применение для контроля излеченности. Лампа Вуда, используемая как вспомогательный скрининговый инструмент, выявляет свечение лишь части возбудителей (прежде всего Microsporum canis) и не является самостоятельным диагностическим критерием.

Распространённость метода в мире

Микологическое исследование входит в стандартную панель услуг референсных и диагностических ветеринарных лабораторий большинства стран мира. Классические методы — прямая микроскопия и культуральное выделение на дерматофит-тест-среде и агаре Сабуро — остаются рутинными и широкодоступными, в том числе в формате point-of-care непосредственно в клинике. В последние годы отмечается выраженная тенденция к внедрению молекулярных и инструментальных методов: полимеразная цепная реакция с секвенированием внутреннего транскрибируемого спейсера становится методом подтверждающей идентификации, а масс-спектрометрия MALDI-TOF всё шире применяется для быстрой идентификации как дрожжевых, так и мицелиальных грибов в ветеринарной практике. Одновременно растёт востребованность определения чувствительности к антимикотикам в связи с нарастающей устойчивостью грибов, в том числе к азолам. Распространённость и доступность метода неравномерны: наиболее полно спектр услуг представлен в специализированных академических и референсных лабораториях Северной Америки и Европы, тогда как в регионах с ограниченными ресурсами, включая тропические страны, микологическая диагностика нередко сведена к культуральному методу без молекулярного подтверждения.

Заключение

Микологическое исследование остаётся краеугольным камнем диагностики грибковых заболеваний животных. Комбинация прямой микроскопии, культурального выделения, инструментальной идентификации и молекулярного подтверждения позволяет не только установить этиологию, но и обосновать рациональную противогрибковую терапию с учётом чувствительности возбудителя. Несмотря на ограничения, связанные с длительностью исследования и интерпретацией выделения грибов-комменсалов, метод сохраняет статус «золотого стандарта» для большинства микозов и продолжает эволюционировать благодаря внедрению масс-спектрометрии и молекулярной диагностики.