Сравнение результатов экспресс-тестов для выявления антигена Giardia duodenalis в пробах фекалий с результатами лабораторных исследований у собак с бессимптомным течением болезни

Stella Ktenas^a, Florian Roeber^b, Maira N. Meggiolaro^c, Athena Ktenas^a, Michael P. Ward^a, Jan Šlapeta^a,d
a Sydney School of Veterinary Science, Faculty of Science, The University of Sydney, New South Wales 2006, Australia
^b Wongaburra Research Centre, Invetus Pty Ltd., NSW 2470, Australia
^c Veterinary Pathology Diagnostic Services, Sydney School of Veterinary Science, University of Sydney, NSW 2006, Australia
^d The University of Sydney Institute for Infectious Diseases, New South Wales 2006, Australia

Основные моменты

• POC-тесты (экспресс-тесты, предназначенные для проведения диагностики по месту лечения) на G. duodenalis у собак проводятся быстро и не требуют специального оборудования.
• Ветеринарные экспресс-тесты демонстрируют значительную достоверность при сравнении с эталонными тестами.
• Экспресс-тесты POC обеспечивают высокую специфичность при первичной диагностике.
• Для получения неоспоримых результатов необходимы подтверждающие тесты, такие как ПЦР (например, MT-ПЦР).

Аннотация

G. duodenalis является одним из наиболее распространённых кишечных паразитов у собак. Экспресс-тесты на выявление антигенов (POC) являются быстрыми и не требуют дополнительного оборудования или специализированной диагностической лаборатории. Целью данного исследования было сравнение диагностических тестов, доступных в ветеринарных клиниках и в диагностической лаборатории, для выявления Giardia duodenalis у собак, содержащихся в группах в Новом Южном Уэльсе, Австралия. Для выявления G. duodenalis использовались два разных экспресс-теста POC. В качестве лабораторных тестов применялась панель мультиплексной тандемной ПЦР (MT-PCR), которая включает выявление ДНК G. duodenalis, и два контрольных теста (собственная TaqMan ПЦР в реальном времени и прямой иммунофлуоресцентный анализ, РИФ). Образцы фекалий собак (n = 40) были одновременно исследованы с целью выявления G. duodenalis. При использовании РИФ или TaqMan ПЦР-РВ в качестве контрольных тестов 77,5% (31/40) и 82,5% (33/40) собак дали положительный результат соответственно. Согласованность (каппа) между DFA и TaqMan ПЦР-РВ составила 0,84 (95% ДИ от 0,64 до 1,00). Между двумя экспресс-тестами POC на G. duodenalis наблюдалось практически совпадение результатов, каппа = 0,75. При сочетании двух экспресс-тестов POC чувствительность составила 77%, а специфичность — 100% при использовании DFA в качестве эталона, а для TaqMan в режиме реального времени — 73% чувствительности и 100% специфичности. MT-ПЦР показала отличное соответствие каждому эталонному тесту — РИФ или TaqMan ПЦР-РВ. Благодаря высокой специфичности обоих тестов POC их можно с уверенностью использовать в качестве экспресс-диагностики. Подтверждающий тест, который обнаруживает различные биологические параметры, такие как ДНК, — например, ПЦР (вкл. МТ-ПЦР), должен быть выполнен прежде, чем будет сделан вывод о том, что у собаки отрицательный результат на наличие G. duodenalis.

Ключевые слова: лямблии, Giardia intestinalis, собачий, диагноз, РИФ, ПЦР в реальном времени, мультиплексно-тандемная ПЦР, диагностика, паразитизм, POC-диагностика, экспресс-тесты

Введение

Giardia duodenalis — один из самых распространённых у собак кишечных паразитов, наиболее восприимчивы к которому щенки и животные с ослабленным иммунитетом [3; 13; 14]. Заражение собак G. duodenalis, как правило, протекает бессимптомно; если заболевание всё-таки проявилось клинически, то обычно наблюдаются диарея, рвота и потеря веса [15; 13]. Ветеринарные врачи сталкиваются с проблемой выбора теста на G. duodenalis, и было проведено множество исследований для сравнения многочисленных диагностических тестов [18; 19; 11; 13].

К распространённым анализам для выявления G. duodenalis относятся традиционные копроскопические тесты с использованием центрифужной флотации фекалий. Для улучшения визуализации цист G. duodenalis, которые являются биологическим доказательством, в качестве эталонного теста используется метод прямой иммунофлуоресценции (реакция прямой иммунофлуоресценции, РИФ; англ. direct fluorescent antibody test, DFA) [19]. Этот метод использует моноклональные антитела в сочетании с флуорофором для визуализации цист G. duodenalis [19]. Обычными эталонными тестами для обнаружения G. duodenalis в кале являются РИФ и ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan (TaqMan ПЦР-РВ), последняя выявляет ДНК G. duodenalis [5; 9; 10; 11; 13; 18]. У этих методов диагностики есть не только преимущества, но и ограничения: они не быстрые, дорогостоящие и требуют наличия специальных навыков или оборудования [8]. В клинической практике быстрое выявление G. duodenalis помогает начать этиотропную терапию, поэтому предпочтение отдаётся экспресс-тестам на наличие антигенов в пунктах оказания медицинской помощи (POC-тесты, экспресс-тесты POC), поскольку они быстры и просты в использовании [8]. Недавние исследования показали, что требуемые чувствительность и специфичность POC-теста на G. duodenalis составляют не менее 50 и 90% [22; 4; 18; 19; 11; 13; 14].

Целью данного исследования была оценка эффективности диагностических тестов на G. duodenalis, имеющихся в австралийских ветеринарных клиниках, включая два современных экспресс-теста, как по отдельности, так и в комбинации. Для сравнения различных диагностических тестов была выбрана когорта собак группового содержания, с историей высокой распространённости G. duodenalis. Пробы кала, взятые у группы собак, содержащихся в одном помещении, были протестированы с помощью экспресс-тестов, а также ПЦР-планшета внешней диагностической лаборатории, одновременно с РИФ и ПЦР-РВ, которые служили контролем.

Материалы и методы

Отбор проб

Пробы кала (n = 40) были получены от собак (фоксхаундов и биглей), содержащихся в частной научной лаборатории на севере Нового Южного Уэльса, Австралия, в июне 2023 года, и доставлены в охлаждённых контейнерах в Сиднейский университет. Они были направлены лечащим ветеринарным врачом в Диагностическую службу ветеринарных патологий (VPDS) Сиднейского университета для проведения стандартной диагностики на G. duodenalis. Все образцы фекалий были обезличены, хранились при температуре < 4°C и обрабатывались раздельно, чтобы избежать предвзятости исследователя. Все собаки были признаны здоровыми лечащим ветеринаром и не имели признаков клинического лямблиоза на момент сбора проб.

Экспресс-тесты на Giardia duodenalis

POC1. Диагностический набор Anigen Rapid Giardia AG Test Kit (BioNote, Сеул, Южная Корея) — хроматографический иммуноанализ для качественного определения антигена G. duodenalis у собак и кошек, был применён в соответствии с инструкциями производителя. Свежие пробы кала были добавлены в пробирку с разбавителем, перемешаны и затем внесены в тестовое устройство. Любая проба, в которой в течение 10 минут после начала тестирования появилась линия в положении «Т» параллельно с контрольной линией «С», считалась положительной.

POC2. Иммунотест ImmunoCard STAT! Crypto/Giardia Rapid Assay (Meridian Bioscience, Цинциннати, Огайо), хроматографический иммунотест для качественного выявления Cryptosporidium parvum и G. duodenalis, был проведён в соответствии с протоколами производителя. Пробы кала, консервированные 10%-м формалином, соединили с буфером и реагентами, перемешали и добавили в тестовое устройство. Любая проба, в которой в течение 10 минут после начала тестирования появилась линия в позиции «GIAR» параллельно с контрольной линией «CONT», считался положительным.

Выделение нуклеиновых кислот из проб кала

Для выделения ДНК из кала использовался набор Isolate II Fecal DNA (Bioline, Австралия) в соответствии с инструкцией производителя. Примерно 0,15 г каждой пробы кала добавляли в пробирки со стеклянными шариками и буфером для лизиса и гомогенизировали с помощью высокоскоростного гомогенизатора FastPrep® 24 (MP Biomedicals, Австралия) со скоростью 6 м/с в течение 40 с перед выделением ДНК, как уже описывалось ранее [7]. ДНК элюировали в 100 мкл элюирующего буфера и хранили при температуре –20°C. В каждой партии был один бланк-контроль, всего 6 контрольных проб, для проверки на наличие загрязнений.

Собственная ПЦР-РВ с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan для выявления Giardia duodenalis

Цельную ДНК подвергали ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan (TaqMan ПЦР-РВ) для выявления Giardia duodenalis [7; 23]. TaqMan ПЦР-РВ нацелена на 62 п. н. фрагмента 18 S рДНК G. duodenalis (M54878) [21]. Было показано, что TaqMan ПЦР-РВ обладает высокой (более 95%) чувствительностью и специфичностью [21; 19]. Амплификация проводилась с использованием Master Mix Luna® Universal Probe qPCR (New England Biolabs, Австралия) в общем объёме 20 мкл, где конечная концентрация праймеров и зонда составляла 400 нМ и 100 нМ соответственно, плюс 2 мкл матрицы. Условия ПЦР в реальном времени были следующими: 95°C в течение 3 минут, затем 40 циклов при 95°C в течение 10 секунд, 60°C в течение 20 секунд на системе CFX96 Touch™ для ПЦР-РВ (BioRad, Австралия), с анализом на BioRad CFX Manager (BioRad, Австралия). Пороговое значение цикла (Ct-значение) < 40 было выбрано в соответствии с Меггиоларо с соавторами (2019), и в этом исследовании были зафиксированы все Ct-значения < 40. В ПЦР-анализ был включён известный положительный, а также отрицательный контроли G. duodenalis.

Планшет для мультиплексной тандемной ПЦР-диагностики у мелких животных

Для тестирования на High-Plex 24 (Cat.: 91501) использовалась патентованная технология MT-ПЦР (AusDiagnostics, Австралия), состоящая из MT-процессора (системы обработки жидкостей, высокопроизводительная и высокочистая экстракция нуклеиновых кислот, AusDiagnostics, Австралия) в соединении с 384-луночным микропланшетом для ПЦР в реальном времени (амплификатор детектирующий ДТ-прайм, «ДНК-технология», Россия), что позволяет тестировать 24 пробы за один запуск, как описано ранее [7]. Пробы были протестированы на 15 возбудителей, в том числе на Campylobacter jejuni, Cryptosporidium canis, Salmonella spp., G. duodenalis, парвовирус/вирус панлейкопении, вирус чумы плотоядных, коронавирус собак, Clostridium perfringens, энтеротоксин C. perfringens (CPE), C. perfringens netF токсин, Neospora caninum и др. Кроме того, в каждую реакцию введён внутренний контроль, который должен амплифицироваться с определённым коэффициентом, в противном случае проба считается ингибированной (AusDiagnostics, Австралия). Проба считалась положительной с помощью функции «автоматического вызова» в программном обеспечении Easy-Plex, если ампликон давал одну кривую плавления в пределах 1,5°C от ожидаемой температуры плавления, если высота пика была выше 0,2 dF/dT и если ширина пика была ≤3,8°C (AusDiagnostics, Австралия). Относительные значения копийности, C-значения и значения отрыва были зафиксированы для каждой пробы с положительным результатом теста, а количественные значения относительной копийности были определены с помощью автоматизированного сравнения, как описано Стэнли и Шевчуком (2005). Пробы, в которых не было обнаружено более 100 копий G. duodenalis, были признаны сомнительными.

Обнаружение цист Giardia duodenalis при помощи реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ)

Цисты G. duodenalis визуализировали и выявляли с помощью метода прямой иммунофлуоресценции (РИФ) MerIFluor Cryptosporidium/Giardia (Meridian Bioscience, Австралия) посредством мечения моноклональными антителами к G. duodenalis, помеченными флуорофором флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ). Пробы кала, консервированные формалином (10%), наносили на предметное стекло и высушивали перед нанесением реагента в соответствии с инструкциями производителя. Препараты рассматривали под флуоресцентным микроскопом (Olympus BX53, Olympus Australia), оснащённым системой фильтров для флуоресценции ФИТЦ (максимальная длина волны возбуждения — 490 нм; средняя длина волны излучения — 530 нм). Любая проба кала, содержащая одну или несколько цист Giardia яблочно-зелёного цвета и характерной морфологии (овальной формы, длиной 8–12 мкм), считалась положительной на наличие G. duodenalis. Проба кала, не дающая яблочно-зелёной флуоресценции и не имеющая цист характерной морфологии, считалась отрицательной на наличие G. duodenalis. Каждый препарат просматривался в течение 5 минут при 20-кратном поле зрения (200-кратное увеличение), что позволяло рассмотреть весь препарат целиком. Идентификация цист подтверждалась при 40-кратном увеличении. При рассмотрении препаратов положительные пробы оценивались полуколичественно (от низкого к высокому) на наличие цист G. duodenalis в поле зрения объектива 20× (от 1: 1 до <5, от 2: 5 до <20, от 3: 20 до <100, от 4: >100 цист).

Статистический анализ

В предшествующих публикациях в качестве эталонных стандартов назывались РИФ и TaqMan ПЦР-РВ [11; 13]. Доверительные интервалы для оценки доли положительных результатов были рассчитаны с использованием модифицированного метода Вальда, а значения каппа были рассчитаны с помощью QuickCalcs (GraphPad Software, Бостон, Массачусетс, США). Значения каппа <20% указывают на незначительное или слабое согласие, от 20% до 40% указывают на удовлетворительное согласие, от 40% до 60% указывают на умеренное согласие, от 60% до 80% указывают на значительное (существенное) согласие, а значения >80% указывают на отличное (почти полное) согласие. Корреляции рассчитывались с использованием GraphPad Prism версии 10.0.0 для Windows (программное обеспечение GraphPad, Бостон, Массачусетс, США). Учитывалась связь между результатами теста и следующими переменными собаки: породой (фоксхаунд, бигль), полом (самец, самка), кастрационным статусом (да, нет) и возрастом (<12 месяцев, ≥12 месяцев). Результаты теста оценивались либо как качественные, либо как количественные, а неоднозначные результаты ПЦР-теста рассматривались как «отрицательные».

Для определения связи с положительными результатами анализа (бинарный показатель: положительный, отрицательный) использовались модели логистической регрессии, а для количественных данных — непараметрический дисперсионный анализ Краскела — Уоллиса (IBM SPSS v24; IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США).

Доступность данных

Все использованные данные доступны в LabArchives: https://dx.doi.org/10.25833/bpa3-zs69.

Результаты

Между двумя экспресс-тестами (POC1 и POC2) на антиген G. duodenalis была получена значительная согласованность результатов, каппа = 0,75 (95% ДИ от 0,54 до 0,95). Объединение двух экспресс-тестов незначительно улучшило согласованность (каппа = 0,61) по сравнению с отдельными тестами (каппа = 0,49 и 0,52), когда в качестве эталонного теста использовался РИФ или TaqMan ПЦР-РВ (таблицы 1 и 2).

РИФ и TaqMan ПЦР-РВ независимо рассматривались в качестве эталонных тестов при оценке экспресс-тестов POC и результатов MT-ПЦР (таблицы 1 и 2).

Доля положительных проб кала на G. duodenalis варьировалась от 52,5% до 97,5% (таблица 3). Согласованность (каппа) между РИФ и TaqMan ПЦР-РВ составила 0,84 (95% ДИ от 0,64 до 1).

РИФ позволила провести полуколичественную оценку количества цист G. duodenalis в кале. Была выявлена значимая корреляция между количеством цист G. duodenalis и результатами ПЦР; значениями Ct при проведении TaqMan ПЦР-РВ (r Спирмена = –0,60, P = <0,001) и MT-ПЦР для G. duodenalis (r Спирмена = 0,64, P = <0,001). РИФ и TaqMan ПЦР-РВ, использованные в качестве контрольных тестов, показали 77,5% (31/40) и 82,5% (33/40) положительных результатов на G. duodenalis соответственно.

Большинство положительных проб на антиген G. duodenalis показали значения Ct <32 при использовании TaqMan ПЦР-РВ (33/35), за исключением двух проб с поздней амплификацией (FR20: значения Ct = 34,5 и FR29: значения Ct = 38,5), которые были признаны сомнительными. Используя планшет МТ-ПЦР, две пробы были сочтены ингибированными и повторно взяты после разведения 1:10. Одна проба дала отрицательный результат на антиген G. duodenalis (FR38), а другая — с предполагаемым количеством копий ДНК-мишени 8 (FR20). Кроме того, один результат был неоднозначным (FR29), а в четырёх пробах было низкое (2–52) предполагаемое количество копий ДНК-мишени в планшете MT-ПЦР, поэтому они были признаны неоднозначными для G. duodenalis. Планшет MT-ПЦР показал отличное соответствие обоим эталонным тестам.

При использовании качественных (положительных, отрицательных) результатов РИФ возраст и порода были достоверно связаны с положительными результатами теста на G. duodenalis у собак (P = 0,016 и 0,050 соответственно) (таблица 4). При учёте количественных результатов (= количество цист G. duodenalis), тест Kruskal Walis ANOVA продемонстрировал, что существует значительная связь как с породой (P < 0,001), так и с кастрационным статусом (P = 0,039), в то время как возраст и пол не были значимыми (таблица 4).

С помощью TaqMan ПЦР-РВ и дисперсионного анализа Краскела — Уоллиса были выявлены значимые ассоциации с породой (P < 0,001), полом (P = 0,039) и кастрацией (P = 0,016), в то время как возраст не был значимо связан с результатами (таблица 5). Простые тесты χ² для результатов ПЦР (положительные, отрицательные) по возрасту были значимыми (P = 0,041).

Обсуждение

Это исследование показало, что оба экспресс-теста POC для определения антигена G. duodenalis превысили желаемую чувствительность в 50% и специфичность в 90%, следовательно, их можно с уверенностью использовать в качестве экспресс-диагностики для выявления антигена G. duodenalis у собак благодаря их высокой специфичности [4; 19; 11]. Результаты этого исследования согласуются с данными Тейлора с соавторами (2023), которые показали, что экспресс-тест на антиген (Quik Chek, TechLab, Блэксбург, Вирджиния) имеет более низкую чувствительность, чем РИФ или ПЦР в качестве эталонных анализов при использовании у собак с бессимптомным течением болезни. Кроме того, предыдущие исследования показали, что экспресс-тесты POC менее чувствительны по сравнению с TaqMan ПЦР-РВ или РИФ, при этом уровень их чувствительности различается [4; 11; 13; 14; 18; 19; 22]. Уитервийк с соавторами (2018) показали, что экспресс-тест POC SNAP Giardia’test (Idexx) обладает самой высокой специфичностью (99,6%), но TaqMan ПЦР-РВ и РИФ обладают более высокой чувствительностью по сравнению с этим экспресс-тестом (71,9%). Будущие исследования должны подтвердить эти результаты на собаках, имеющих симптомы лямблиоза.

Результаты этого исследования показывают, что сочетание двух различных экспресс-тестов для определения антигенов незначительно повысило способность выявлять собак, инфицированных G. duodenalis, что соответствует умеренной корреляции с обоими эталонными методами диагностики. В будущих исследованиях следует оценить эффективность комбинирования нескольких экспресс-тестов POC с учётом непостоянного характера G. duodenalis, поскольку предыдущие исследования выявили повышенную чувствительность только при серийном взятии проб кала для копроскопического анализа с использованием метода флотации в растворе сульфата цинка [17; 18].

Групповое содержание подопытных животных могло повлиять на результаты, поскольку социальное поведение собак способствует фекально-оральной передаче патогенов. Большое количество положительных проб могло быть случайным результатом из-за особенностей группового содержания, а не признаком настоящей инфекции [16]. Важно отметить, что у бессимптомно инфицированных G. duodenalis собак может развиться диарея при физическом стрессе, что может быть актуально при групповом содержании [16]. Полученные результаты могут быть применимы и для других ситуаций группового содержания, таких как племенные питомники или приюты для домашних животных.

Меггиоларо и соавторы (2019) оценили планшет MT-ПЦР для выявления G. duodenalis у кошек и продемонстрировали 95% чувствительность и 92% специфичность по сравнению с тем же анализом TaqMan ПЦР-РВ. Использование MT-ПЦР для диагностики G. duodenalis у собак без симптомов заболевания в рамках данного исследования дало результаты, сопоставимые с эталонным анализом TaqMan ПЦР-РВ. Лауд с соавторами (2016) продемонстрировали высокую чувствительность MT-ПЦР по сравнению с ПЦР-РВ в пробах человеческой крови. Оба эталонных анализа дали сопоставимые результаты и впоследствии были признаны достаточными для оценки экспресс-теста. Несколько исследований показали преимущества использования байесовского подхода при сравнении тестов без эталонного диагностического образца, в том числе при диагностике G. duodenalis [19; 11; 14; 1; 2]. Два установленных эталонных стандарта и небольшой размер выборки, особенно для собак с отрицательным результатом на антиген G. duodenalis, ограничили применение байесовских моделей скрытых классов.

Авторы выбрали метод TaqMan ПЦР-РВ из-за его высокой специфичности и минимального риска перекрёстных реакций с другими паразитозами и фекальными массами [21; 20]. Пороговое значение цикла (Ct-значение <40) было выбрано в соответствии с критериями, установленными Меггиоларо с соавторами (2019). Однако важно отметить ограничение этого исследования — периодическое выделение цист G. duodenalis с калом инфицированных собак [17, 18]. Такое периодическое выделение цист потенциально снижает полезность, эффективность и точность используемых для диагностики методов, основанных на наличии цист (РИФ) или ДНК самих паразитов (ПЦР) в кале. Одним из возможных способов преодоления этого ограничения является серийное тестирование — стратегия, которую можно было бы изучить в будущих исследованиях для повышения надёжности методов обнаружения.

Заключение

Это исследование продемонстрировало, что два описанных экспресс-теста для определения антигена G. duodenalis, использованные отдельно и в комбинации, обеспечивали уверенность в том, что положительный результат на антиген G. duodenalis представляет собой истинно положительный результат теста при обнаружении G. duodenalis у пациента-собаки. Из-за более низкой чувствительности экспресс-тестов POC на антиген в целом, прежде чем делать вывод о том, что у собаки отрицательный результат на наличие антигена G. duodenalis, следует выполнить подтверждающее тестирование, которое обнаруживает различные биологические параметры, такие как ДНК, — например, ПЦР (включая планшет МТ-ПЦР).

Вклад авторов. Стелла Ктенас: первоначальный черновик, методология, исследование, формальный анализ, обработка данных, концептуализация. Флориан Роубер: обзор и редактирование, ресурсы, методология, исследование. Майра Н. Меггиоларо: ресурсы, методология, исследование, формальный анализ. Афина Ктенас: обзор и редактирование, методология, формальный анализ. Майкл П. Уорд: обзор и редактирование, программное обеспечение, ресурсы, методология, формальный анализ, обработка данных. Ян Шлапета: обзор и редактирование, руководство, ресурсы, управление проектом, методология, обработка данных, концептуализация.
Информирование о пересекающихся интересах. Авторы заявляют о следующих финансовых интересах/личных связях, которые могут рассматриваться как потенциальные конкурирующие интересы: редакционная коллегия журнала «Ветеринарная паразитология» (JS).
Благодарности. Эта работа была выполнена в рамках требований для получения степени доктора ветеринарной медицины в Сиднейском университете (SK). Это исследование было частично профинансировано Sydney School of Veterinary Science Research & Enquiry Unit of Study 2023 fund.
Источник: Veterinary Parasitology 327 (2024) 110139. © 2024 The Author(s). Published by Elsevier B. V. This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

СВМ № 3/2025