Lisa Macrory, Anne Vaughan-Thomas, Peter D. Clegg и John F. Innes
Исследовательская группа по опорно-двигательному аппарату факультета ветеринарии Ливерпульского университета, Лихёрст Кампус, Нестон, Виррал, Великобритания

Аннотация

Введение. В исследовании изучается способность тепоксалина, двойного ингибитора циклооксигеназы (ЦОГ) и липоксигеназы (ЛОГ), и его активного метаболита снижать катаболическое воздействие цитокинов на хрящ in vitro в модели собачьего остеоартрита (ОА). Макроскопически сохранная хрящевая ткань была собрана посмертно у семи собак, у которых отсутствовали признаки поражения суставов. Хрящевые эксплантаты были выращены в среде, содержащей рекомбинантный собачий интерлейкин-1β (РСИЛ-1β) в концентрации 100 нг/мл и рекомбинантный человеческий онкостатин-M (РЧОСМ) в концентрации 50 нг/мл. Эффект тепоксалина и его метаболита изучался в трех концентрациях — 1×10^-5, 1×10^-6 и 1×10^-7 моль. В качестве показателей истощения протеогликана и коллагена в хряще использовались уровни общего гликозаминогликана (ГАГ) и высвобожденного коллагена (гидроксипролина) соответственно. Для изучения эффекта препарата на активность ЦОГ и ЛОГ определяли уровень простагландина Е₂ (ПГЕ₂) и лейкотриена B₄ (ЛТB₄).
Результаты. Применение ИЛ-1β и ОСМ приводило к значительной активации высвобождения и коллагена (p = 0,004), и протеогликана (p = 0,001) из эксплантата. Воздействие тепоксалина в концентрациях 1×10^-5 молей и 1×10^-6 молей приводило к снижению высвобождения коллагена из эксплантатов (p = 0,047 и p = 0,075), однако не оказало никакого эффекта на высвобождение ГАГ. Концентрация ПГЕ2 в культуральной среде на 7-й день значительно повысилась из-за ИЛ-1β и ОСМ. Тепоксалин и его метаболит продемонстрировали тенденцию к дозозависимому снижению выработки ПГЕ₂. Концентрации ЛТB₄ были слишком низки для определения. Исследование цитотоксичности не выявило негативного эффекта тепоксалина и его метаболита на хондроциты в исследованных концентрациях.
Выводы. Настоящее исследование показывает, что тепоксалин в концентрации 10^-5 молей ингибирует ЦОГ и может снижать потерю коллагена из эксплантатов хрящевой ткани собаки in vitro. Таким образом, в этой модели тепоксалин может частично подавить дегенерацию хряща при непосредственном локальном воздействии на ткань.

Введение

Остеоартрит (ОА) является наиболее распространённой артропатией у млекопитающих, которая поражает приблизительно 20% взрослых собак [1]. Это заболевание обычно лечится нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), часто в течение многих месяцев или лет.

ОА характеризуется дегенерацией и истощением суставного хряща. Хрящевая ткань состоит из хондроцитов, которые формируют экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ), состоящий в основном из воды, коллагена II типа и протеогликанов [2]. Основной протеогликан хряща, аггрекан, содержит большое количество гликозаминогликановых (ГАГ) цепей. Коллаген обеспечивает прочность при растяжении ткани, тогда как аггрекан впитывает воду, обеспечивая упругость при сдавлении [3]. Потеря аггрекана на ранних этапах ОА собаки обусловлена деструктивной активностью фермента аггреканазы (ADAMTS-4, -5) [4]. Потеря аггрекана делает коллагеновую сеть восприимчивой к деструкции матриксными металлопротеазами ММП-1 и -13 [5; 6]. Итогом усиленного распада и неадекватного синтеза становится постепенная потеря ткани. Считается, что усиление деградации матрикса и снижение синтеза опосредуется катаболическими цитокинами, такими как интерлейкины (ИЛ-1β, ИЛ-6) и онкостатин-М (ОСМ) [7–9].

Культивация хрящевых эксплантатов хорошо зарекомендовала себя как инструмент исследования воспалительных процессов. Модели деградации хряща in vitro разработаны для некоторых домашних животных [10; 11], включая представляющие интерес для ветеринарии виды [12–14]. В этих моделях для индуцирования распада хряща и подавления синтеза матрицы в хрящевых эксплантатах из нормальных суставов используются разнообразные катаболические цитокины. Измеряемыми показателями деградации хряща эксплантатов служат количества гликозаминогликана и гидроксипролина (высвобожденного коллагена) в культуральной среде.

Потребность в препаратах, способных затормозить, остановить или обратить развитие ОА и сохранить целостность хрящевой ткани, совершенно очевидна. Поскольку НПВП рутинно используются, часто весьма длительно, для контроля над болью при ОА, их воздействие на хрящ уже изучалось. Ранние исследования 1980-х годов показали, что аспирин негативно влияет на хрящевой метаболизм в модели собачьего ОА in vivo [15]. Подчёркивая учащение использования в клинической практике препаратов, обладающих расширенной селективностью в отношении ЦОГ-2, недавние исследования показали некоторый ограниченный положительный эффект карпрофена (римадила) на синтез аггрекана in vitro [14]. До настоящего времени воздействию на механизмы деградации хряща уделялось недостаточно внимания.

Возможно, желаемый эффект достижим с помощью ингибирования опосредованных циклооксигеназой и липоксигеназой путей хрящевого метаболизма, что подчёркивается в недавней работе по двойным ингибиторам ЦОГ/ЛОГ. Исследования ликофелона (ML-3000) в экспериментальной модели собачьего ОА (Pond-Nuki) показали, наряду с ожидаемым подавлением выработки ПГЕ₂ и ЛТB₄, способность этого препарата замедлять прогрессирование ОА в сравнении с контролем [16]. В частности, в этом исследовании было показано снижение ММП-1 и ИЛ-1β в хряще после воздействия препарата. Хотя прямое сравнение не проводилось, исследователи считают, что эффект ликофелона был более выраженным, чем эффект карпрофена, который те же авторы исследовали на такой же модели [17]. Больше того, было показано, что ликофелон снижает генную экспрессию ММП-13, ADAMTS-4 и катепсина К, с соответствующим снижением уровня этих белков [18].

Тепоксалин — двойной ингибитор ЦОГ/ЛОГ. Предыдущее исследование показало, что тепоксалин может снижать продукцию ИЛ-1 человеческой синовиальной тканью в органной культуре [19], в связи с чем возникло предположение о положительном воздействии тепоксалина на хрящ при ОА, ограничивающем как продукцию эндогенного ИЛ-1, так и последующую опосредованную ММП деградацию ткани.

Целью настоящего исследования было использование модели собачьего ОА in vitro для проверки гипотезы, что тепоксалин, двойной ингибитор ЦОГ/ЛОГ, способен замедлить стимулированный цитокинами катаболизм хряща. ОСМ и ИЛ-1β были прежде описаны как возможные стимуляторы деградации хряща [7; 20]. Определение общего ГАГ и высвобожденного коллагена (гидроксипролина) в культуральной среде использовались для измерения распада протеогликана и коллагена соответственно. Мы показали, что тепоксалин в концентрациях 1×10^-5 и 1×10^-6 молей привёл к снижению высвобождения коллагена из эксплантатов суставного хряща in vitro.

Методы

Сбор и культивирование материала

Макроскопически сохранный суставной хрящ был собран с мыщелка бедренной кости и из кондило-трохлеарной вырезки у семи собак, усыплённых по причинам, не связанным с нарушениями опорно-двигательного аппарата и не имеющим отношения к настоящему исследованию. Посмертное обследование этих собак не выявило признаков грубой патологии суставов. Перед сбором материала у владельцев собак было получено полное информированное согласие. В асептических условиях хрящевые эксплантаты были трижды промыты в бессывороточной среде Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) с добавлением 300 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (все — Cambrex, Уоркингхэм, Великобритания).

Исследование деградации хряща

Отдельные хрящевые эксплантаты (приблизительно 0,75 см²) поместили в 24-луночную плашку для тканевых культур, содержащую 1 мл бессывороточной среды DMEM с добавлением 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина, как описано в других исследованиях [21]. Каждый отдельный эксперимент проводился на трёх идентичных экземплярах эксплантата. Во все культуры, за исключением негативного контроля (тоже тройного), были добавлены рекомбинантный собачий (РС) ИЛ-1β (R&D Systems, Абингдон, Великобритания) и рекомбинантный человеческий (РЧ) ОСМ (Peprotech, Лондон, Великобритания) в конечных концентрациях 100 нг/мл и 50 нг/мл соответственно. Эффект тепоксалина и его метаболита изучали в трёх концентрациях — 1×10^-5, 1х10^-6 и 1×10^-7 моль, которые, согласно предыдущим исследованиям, соответствуют дозам, достигаемым в человеческих суставах при лечении [22]. К тому же данные по фармакокинетике лицензированной формы тепоксалина (зубрин, Intervet/Schering Plough Animal Health) и его активного метаболита указывают на то, что максимальная концентрация препарата в плазме, достигаемая при использовании рекомендованной нагрузочной дозы 20 мг/кг с последующим шестидневным курсом 10 мг/кг, варьируется от 1,48×10^-6 молей до 2,8×10^-6 молей. Это означает, что выбранные нами концентрации перекрывают желаемую концентрацию в синовиальной сумке. Культуры поддерживались в увлажнённой газовой смеси (95% воздуха и 5% CO2) при 37°C в течение 28 дней. Среда, содержащая стимуляторы и препарат, собиралась и пополнялась каждые 7 дней. Собранная среда сохранялась при –20°C перед анализом на ГАГ и гидроксипролин. Уровень ГАГ определялся в образцах среды, собранных на 7-й день, тогда как высвобожденный коллаген измерялся в образцах, собранных через 7, 14, 21 и 28 дней. Для определения уровня общего ГАГ и коллагена в эксплантате оставшийся хрящ подвергали перевариванию в папаине (Sigma, Великобритания) в концентрации 10 Ед/мл, ацетате натрия (0,1 моля), этилендиаминуксусной кислоте (2,4 ммоля) и L-цистеине (5 ммолей) при pH 5,8 и 60°C в течение ночи.

Распад протеогликана

Уровень общего ГАГ определялся в среде, собранной на 7-й день, с помощью модифицированного метода связывания прямым диметилметиленовым синим красителем [23]. Концентрация ГАГ была установлена путём измерения оптической плотности при длине волны 570 нм. Для построения стандартной кривой (от 5 до 40 мкг/мл) использовался акулий хондроитин сульфат с 1,9-диметилметиленовым синим (оба — Sigma). Оптическая плотность измерялась на планшет-ридере Dynex revelation 4.04 (DYNEX technologies). Значения приводились в миллиграммах на 1 грамм сырого веса ткани.

Распад коллагена

Среда, собранная через 7, 14, 21 и 28 дней, а также ткань, переваренная папаином, в течение ночи подвергались гидролизу в 6 молях HCl при 110°C и впоследствии были высушены сублимацией. Лиофилизированный материал растворили в дистиллированной воде. Затем по описанной ранее методике [21] был провёден анализ аликвот по 40 мкл растворенного материала со стандартными пробами гидроксипролина с целью определения общего коллагена.

Оптическая плотность измерялась при длине волны 560 нм с помощью ридера Multiskan EX (Thermo Scientific). Совокупные количества гидроксипролина, высвобожденного из коллагена в среду за 28 дней культивации, были рассчитаны в процентах от общего гидроксипролина в эксплантате.

Воздействие тепоксалина на активность ЦОГ и ЛОГ в хряще

Концентрации ПГE₂ и ЛТB₄ в среде (собранной на 7-й день) были установлены с помощью коммерческих наборов ELISA (R&D systems) в соответствии с инструкцией производителя. Оптическую плотность измеряли на планшет-ридере Dynex revelation 4.04 при длине волны 450 нм, корректирующие измерения производились при длине волны 570 нм. Для каждой плашки была разработана соответствующая многозвенная кривая, и с помощью этих моделей рассчитывались концентрации ПГE₂ или ЛТB₄ в образцах из каждой плашки.

Исследование токсичности

У двух собак без признаков патологии суставов собрали макроскопически неизменённую хрящевую ткань. Эксплантаты культивировались в трех экземплярах на 96-луночной плашке 24 и 48 часов в 100 мкл бессывороточной среды, содержащей катаболические цитокины (100 нг/мл ИЛ-1β и 50 нг/мл ОСМ), а также тепоксалин или его метаболит в концентрациях 1×10^-5, 1×10^-6 или 1×10^-7 молей. Эксплантаты также культивировались в трех экземплярах для негативного (бессывороточная среда) и позитивного (бессывороточная среда, содержащая ИЛ-1β и ОСМ) контроля. Среда собиралась на обоих контрольных сроках и заменялась 100 мкл бессывороточной DMEM и 10 мкл лизирующего буфера (поставлялся в наборе). Перед анализом эксплантаты замораживались при –70°C минимум на 1 час. Анализ собранной среды и лизатов клеток эксплантата выполнялся с помощью коммерческого набора для исследования нерадиоактивной цитотоксичности Cytox96^® (Promega, Саутгемптон, Великобритания), который регистрирует высвобождение фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ), указывающее на потерю целостности клеток.

Статистическая обработка

Статистическая обработка включала сравнение эксплантатов от семи собак в трё х экземплярах, на которые воздействовали тепоксалином и его метаболитом, с таким же количеством эксплантатов, подвергшихся воздействию только цитокинов, с помощью смешанных линейных регрессионных моделей, где донор выступал в качестве случайного эффекта. Там, где это было применимо, данные трансформировались для достижения нормального распределения.

Результаты

Распад протеогликана в эксплантатах под воздействием цитокинов

Наши предыдущие исследования хрящевых эксплантатов показали, что воздействие ИЛ-1β и ОСМ значительно, по сравнению с контролем, увеличивает распад протеогликана (измерения производились на 7-й день эксперимента) [13]. Мы использовали эти данные для того, чтобы определить, будет ли влиять добавление тепоксалина или его метаболита на количество высвобожденного протеогликана в культуральной среде. Как было показано, воздействие ИЛ-1β и ОСМ значительно ускоряет распад протеогликана, в среднем в 2,7 раза (n = 7, p = 0,001). Тепоксалин и его метаболит в использованных концентрациях не оказали значимого эффекта на количество высвобожденного из эксплантатов протеогликана (илл. 1).

Высвобождение коллагена из эксплантатов под воздействием цитокинов

У всех доноров, кроме одного, наблюдалось значительное повышение (в среднем в 6,4 раза, p = 0,004) высвобождения коллагена (после 28 дней) из эксплантатов, культивированных в присутствии ИЛ-1β и ОСМ, что соответствует результатам предыдущих исследований. Добавление тепоксалина в концентрации 1×10^-5 моль привело к значительному снижению высвобождения коллагена (в среднем в 1,39 раза, p = 0,047), тогда как тепоксалин в концентрации 10^-6 молей показал тенденцию к значительному снижению распада коллагена (в 1,35 раза, p = 0.075) (илл. 2). Добавление тепоксалина в концентрации 1×10^-7 моль, а также его активного метаболита вызвало меньшее снижение высвобождения коллагена, однако этот эффект не был статистически значимым.

Концентрации ПГE₂ в среде

Применение ОСМ и ИЛ-1β вызвало значимое 98-кратное увеличение ПГE₂ в среде в группе положительного контроля в сравнении со средой из негативного контроля. Добавление тепоксалина в концентрациях 1×10^-5, 1×10^-6 или 1×10^-7 моль снизило уровень ПГE2 в 4,80, 1,66 и 1,55 раз соответственно (илл. 3). Добавление его активного метаболита в концентрациях 1×10^-5, 1×10^-6 или 1×10^-7 моль также привело к выраженному снижению уровня ПГE2 (в 8,26, 9,22 и 2,25 раза соответственно). Концентрации ЛТB₄ в среде, собранной из эксплантатов на 7-й день, не определялись ввиду их низкого уровня (данные не представлены). Культивирование монослойных культур в течение 24 часов для получения определяемых уровней ЛТB₄ также не позволило получить данные с помощью имевшихся методов определения (данные не представлены).

Цитотоксичность препарата

Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из клеток или эксплантатов в тканевую культуральную среду служит маркером нарушения целостности клеточной мембраны и указывает на смерть клетки. Ни после 24 часов, ни после 48 часов присутствия тепоксалина или его метаболита в культуральной среде уровень ЛДГ не был значимо выше, чем в средах с цитокинами отдельно (без препарата) (илл. 4).

Обсуждение

Результаты настоящего исследования доказывают, что тепоксалин ингибирует индуцированную цитокинами активность ЦОГ и может в концентрации 10^-5 молей в известной мере снижать потерю коллагена из эксплантатов хряща собаки in vitro. Более глубокое понимание патофизиологии ОА повлекло за собой разработку множества препаратов для лечения этого заболевания. Многие другие ингибиторы ЦОГ, такие как НПВП, использовались в практике в течение многих лет. Несмотря на то, что они очень эффективно борются с симптомами заболевания (Husni et al., 2001), их способность замедлять прогрессирование экспериментального ОА in vivo ограничены [17]. К тому же они даже могут оказывать прямой негативный эффект на хрящ [15; 24]. Недавние исследования указывают на потенциальную способность двойных ингибиторов ЦОГ/ЛОГ отсрочивать прогрессирование ОА. В одном исследовании [16] выявлено, что ML-3000, двойной ингибитор ЦОГ/ЛОГ, более эффективно замедляет развитие ОА в собачьей модели, чем другие НПВП, такие как тиапрофеновая кислота и карпрофен. Предположительно, это свойство ML-3000 связано с его способностью помимо ПГE₂ ингибировать ЛТB₄.

Для имитации прогрессирующей деградации хряща, наблюдаемой при ОА, были разработаны модели in vitro с использованием хрящевых эксплантатов, собранных с суставных поверхностей. В таких моделях хрящ изолирован, что позволяет изучать прямое воздействие на него биологических стимуляторов и фармакологических препаратов. Стимуляция хондроцитов интерлейкином-1β приводит к ингибированию синтеза макромолекул ЭЦМ, таких как аггрекан и коллаген, и повышению продукции веществ, разрушающих матрикс, таких как ММП. С этим согласуются результаты нашего исследования, которые показывают, что присутствие РСИЛ-1β и РЧОСМ приводит к значительному усилению распада коллагена и протеогликана. В настоящем исследовании и тепоксалин, и его активный метаболит добавляли в культуральную среду для исследования их воздействия на модель хряща. Мы обнаружили, что тепоксалин снижает стимулированный ИЛ-1β и ОСМ распад коллагена, но не оказывает значимого эффекта на распад протеогликана. Для индукции распада коллагена требуется совместное воздействие ИЛ-1β и ОСМ, в связи с чем он более подвержен ингибированию на этом этапе. Необходимо с осторожностью исключать возможность того, что метаболит тепоксалина способен предотвратить потерю хряща in vivo, поскольку внутри сустава хрящ не изолирован и воздействие тепоксалина и его метаболита на окружающие ткани может играть важную роль в предотвращении синтеза провоспалительных цитокинов.

Мы не рассмотрели дозозависимый эффект на высвобождение коллагена, потому что наши концентрации тепоксалина и его метаболита были в области его терапевтического коридора. Возможно, более высокие концентрации привели бы к более выраженному эффекту, но мы не хотели выходить за пределы терапевтического коридора. Очевидно, что in vivo невозможно будет достичь более высоких концентраций из-за системной токсичности и потенциальных побочных эффектов. Снижение деградации коллагена — это теоретически благоприятный эффект [25; 26], и даже если он невысок, он может внести существенный вклад в борьбу с развитием такого медленно прогрессирующего заболевания, как ОА, потому что НПВП могут применяться месяцами и годами. Однако необходимо проводить дальнейшие исследования in vivo прежде, чем станет возможным внедрить эти открытия в клиническую практику.

Отсутствие эффекта на высвобождение ГАГ, возможно, удивит, но существует вероятность, что на результат повлияли условия эксперимента. Высвобождение ГАГ в ожидаемых пределах произошло даже в группе негативного контроля, в связи с чем чувствительность системы при определении разницы между позитивным и негативным контролем ограничена и малые различия могут остаться незафиксированными. К тому же лёгкость, с которой индуцируется распад протеогликана in vitro (ИЛ-1β и ОСМ инициируют высвобождение ГАГ и по отдельности, и в комбинации), позволяет предположить, что этот распад, будучи запущенным, мало подвержен ингибированию. Известно, что в предыдущих исследованиях НПВП, такие как ингибитор ЦОГ-2 целекоксиб, показали способность снижать высвобождение резидентного и вновь синтезированного ГАГ в человеческом хряще при моделировании ОА in vitro [27].

Наши данные по цитотоксичности показывают, что ни тепоксалин, ни его активный метаболит не оказывали явного токсического эффекта на хондроциты в эксплантатах к моменту забора образцов. Хотя можно ожидать появления токсического эффекта в коротком периоде, в нашем исследовании мы ограничились заборами образцов через 24 и 48 часов культивирования.

И тепоксалин, и его метаболит прежде демонстрировали дозозависимое снижение уровня ПГE₂ в модели синовиальной ткани in vitro [28]. Willburger и колл. [28] сообщали, что окисленный метаболит — это чистый ингибитор ЦОГ в изоляте фермента, и показали, что он может ингибировать высвобождение и ПГ, и ЛТC₄. Хотя механизм действия метаболита остаётся неясным, прямое ингибирование 5-липоксигеназы или 12-липоксигеназы было исключено. Существуют гипотезы о других возможных механизмах действия, таких как ингибирование цитозольной фосфолипазы A₂.

По контрасту со своим метаболитом тепоксалин проявляет множественную ингибирующую активность: на ЦОГ, 5-ЛО и 12-ЛО [28]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что метаболит способен снижать вызванное цитокинами повышение ПГE₂ выраженнее, чем тепоксалин в соответствующей концентрации, однако в отличие от тепоксалина он не снижал значимо потерю коллагена из эксплантатов. Из этого следует, что, возможно, снижение стимулированного цитокинами распада коллагена, полученное при применении тепоксалина в концентрациях 10^-5 и 10^-6 молей, было следствием его способности ингибировать несколько ферментов и его воздействия на биосинтез лейкотриенов.

Анализ эксплантатов, культивированных в присутствии и цитокинов, и тепоксалина в концентрации 10^-5 молей, что в пределах терапевтического коридора, показал снижение уровня ПГЕ₂ и высвобождения коллагена по сравнению с эксплантатами, культивированными в присутствии одних цитокинов. Необходимы дальнейшие исследования с целью поиска объяснения этих открытий, хотя можно предположить, что в этих эксплантатах может быть снижен синтез ИЛ-1β вследствие сниженной активности ЦОГ, которая, в свою очередь, может быть причиной снижения распада коллагена. В то время как роль ПГЕ₂ в воспалении хорошо известна, существуют свидетельства о прямой патогенной роли в ОА побочных продуктов опосредованных 5-ЛОГ реакций, в частности ЛТB₄ [29]. В поражённой ОА синовиальной мембране и in vitro, и in vivo ЛТB₄ стимулирует синтез таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-1β и фактор некроза опухоли a (ФНОa) [30], а также матриксных металлопротеаз (ММП).

Наши открытия показывают, что и тепоксалин, и его метаболиты имеют общую склонность к дозозависимому снижению уровня ПГЕ₂. К сожалению, несмотря на разнообразие моделей in vitro нам не удалось достичь определяемых уровней ЛТB₄. Известно, однако, что ЛТB₄ (и ЛТC₄) в суставе имеют скорее синовиальное, чем хрящевое происхождение (Wittenberg et al., 1993), что может служить объяснением низких уровней ЛТB₄, наблюдавшихся в настоящем исследовании. Вследствие этого мы не могли количественно определить ЛТB₄ в наших тестах из-за их ограниченной чувствительности.

Выводы

Настоящее исследование продемонстрировало, что тепоксалин, двойной ингибитор ЦОГ и ЛОГ, статистически значимо снижает потерю коллагена in vitro в экспериментальной модели ОА. В то время как ни тепоксалин, ни его метаболит не смогли уменьшить потерю ГАГ in vitro, тепоксалин снизил потерю коллагена. Механизмы, обеспечивающие эту разницу, требуют дальнейшего изучения.

Вклад авторов. L. M. проводила эксперименты, выполнила часть статистической обработки и написала черновик рукописи. A. V.-T. давала полезные советы по планированию лабораторных экспериментов, интерпретации данных и помогала писать черновик рукописи. P. D. C. участвовал в разработке исследования, консультировал, частично выполнил статистическую обработку и помогал писать черновик рукописи. J. F. I. был автором идеи исследования, участвовал в его разработке и координации и помогал писать черновик рукописи. Все авторы прочитали и одобрили финальную версию рукописи.
Благодарности. Полное финансирование проекта, включая зарплату доктора Macrory, было обеспечено компанией Intervet/Schering-Plough Animal Health. Рукопись была одобрена компанией Intervet/Schering-Plough Animal Health и допущена к публикации без изменений.

Источник: BMC Veterinary Research 2009, 5:25doi:10.1186/1746-6148-5-25. © 2009 Macrory et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly.

СВМ №2/2011