Типы анализаторов и методы их работы
Основными субпопуляциями лейкоцитов, часто определяемыми врачами клинической лабораторной диагностики, и клинически значимыми для лечащего врача, являются нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, лимфоциты и моноциты. На данный момент существует 2 типа анализаторов: производящие анализ лейкоцитарной формулы по 3 (3Diff) и 5 субпопуляциям (5Diff) лейкоцитов.
Помимо разницы в количестве анализируемых субпопуляций приборы также отличаются по принципу своей работы.
Анализаторы, выполняющие дифференцировку по 3 субпопуляциям, работают по принципу кондуктометрии (апертурно-импедансный принцип Коултера). Такие приборы определяют до 22 параметров, предлагают врачу 3 гистограммы распределения (эритоциты — RBC, тромбоциты — PLT, лейкоциты — WBC) и используют 2–3 реагента. Большинство 3Diff анализаторов работает по принципу открытой реагентной системы (в них возможно использовать реагенты разных производителей; системы закрытого типа используют только оригинальные «ПАКи» — комплекты реагентов со штрих-кодом, запрограммированные на определённое количество тестов).
Анализаторы, выполняющие дифференцировку по 5 субпопуляциям, как правило, совмещают апертуро-импедансный и оптический методы. Такие как лазерная дифференцировка, цитохимия, химическое окрашивание, световая абсорбция, а также фотометрический метод определения гемоглобина (HGB). Эти анализаторы определяют более 24 параметров, предлагают врачу не только гистограммы, но и скатерограммы (точечные диаграммы) и используют более 3 реагентов.
Принцип Коултера основан на том факте, что частицы, движущиеся в электрическом поле, вызывают в нём измеримые возмущения (илл. 1). Величины этих возмущений пропорциональны размеру частиц в поле. В зависимости от их величины клетки распределяются на гистограмме. Приборы, работающие по данной технологии, довольно чувствительны, просты в обслуживании, но ограничены по некоторым показателям.
Проточная лазерная цитометрия — метод, позволяющий дифференцировать сложные для распознавания кондуктометрическим прибором клетки крови (например, ретикулоциты). Принцип метода проточной цитометрии на регистрации светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки, регистрируют рассеянное лазерное излучение каждой клетки.
Проточная цитофлуориметрия основана на применении специального флуоресцентного красителя (метки) для некоторых видов клеток. Метод применяется совместно с проточной лазерной цитометрией, подходит для более точного определения IMG (#, %), HFC (#, %), RET (#, %), NRBC (#, %). Приборы, работающие по данной технологии, позволяют получить быстрый ответ по каждой из субпопуляций. Имеют закрытую систему реагентов (ПАК), довольно дорогостоящие в обслуживании и сервисе.
[Сокращения: # — количественное соотношение; % — процентное соотношение; IMG — незрелые гранулоциты; HFC — клеточные популяции с высоким уровнем флуоресценции; RET — ретикулоциты; NRBC — ядросодержащие эритроциты (с коррекцией WBC)]Полученный сигнал при лазерной цитометрии и цитофлуореметрии передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных гистограмм и скатерограмм. Это позволяет получить представление о размерах и структуре клетки, распределении клеток разного размера и их внутренней структуре (илл. 2).
 |
 |
| Илл. 1 | Илл. 2 |
Особенности анализаторов для ветеринарии
Ветеринарные анализаторы отличаются от предназначенных для людей тем, что имеют значимо большие возможности сервисных настроек.
У людей и животных разные объёмы клеток крови. То же можно сказать о различии в объёме клеток у разных видов животных, что приводит к необходимости устанавливать разные нормы для разных видов животных и невозможность использования медицинских клинических анализаторов в ветеринарии.
Анализатор, применяемый в ветеринарии, должен иметь возможность программирования профилей разных животных с возможностью изменения референсных значений, а также должен иметь возможность работы с небольшим объёмом исследуемого материала. Помимо этого, каждый анализатор запрограммирован на определённую степень разведения образца крови для выполнения анализа, таким образом, количество подаваемого лизирующего раствора или изотонического разбавителя на одну пробу должно отличаться в зависимости от профиля животного.
Однако анализаторы могут не всё. С точки зрения врача клинической практики важна оценка морфологии клеток, как эритроцитарного, лейкоцитарного так и тромбоцитарного ростков. Также мы можем встречаться с ложным завышением или занижением показателей перечисленных ростков. К сожалению, данные параметры невозможно оценить на гематологическом анализаторе, поэтому необходима оценка «глазами лаборанта».
С какими ошибками мы можем столкнуться?
Лейкоцитарный росток
Оценка сдвига лейкограммы влево (илл. 3), а именно наличие молодых форм лейкоцитов (илл. 6) — один из важнейших параметров, который не оценивается 3Diff анализаторами, а 5Diff выдаёт этот подсчёт некорректно (при этом не оценивает наличие юных и бластных форм). Также мы можем столкнуться с ложным завышением общего количества лейкоцитов, за счёт наличия молодых ядерных форм эритроцитарного ростка — нормоцитов (илл. 4).
С помощью анализатора нет возможности провести оценку наличия токсических изменений лейкоцитов, таких как базофилия цитоплазмы (илл. 5), тельца Деле и иных. Данные изменения важны для оценки прогноза заболевания и его тяжести, но выявить их можно только при микроскопии окрашенного мазка крови.
Также анализатор не даёт возможности обнаружить кровепаразитов, находящихся в цитоплазме лейкоцитов.
 |
 |
| Илл. 3. Молодые формы лейкоцитов | Илл. 4. Ядерные формы эритроцитов |
 |
 |
| Илл. 5. Базофилия цитоплазмы, гигантизм нейтрофилов | Илл. 6. Кольцевидное ядро у палочкоядерного нейтрофила |
Тромбоцитарный росток
Ложное занижение общего количества тромбоцитов может происходить по разным причинам, которые возможно оценить только при исследовании мазка крови. Причиной ложного занижения может являться агрегация тромбоцитов, часто возникающая как реакция на антикоагулянт ЭДТА (илл. 8). При наличии макротромбоцитов анализатор может относить их к эритроцитам, в свою очередь ложно завышая количество последних (илл. 7).
С ложным завышением числа тромбоцитов мы можем столкнуться при наличии фрагментированных эритроцитов (при внутрисосудистом гемолизе, например), такие «осколки» эритроцитов анализатор посчитает как тромбоциты.
 |
 |
| Илл. 7. Макротромбоцит | Илл. 8. Агрегация тромбоцитов |
Эритроцитарный росток
Анализатор не может произвести оценку морфологических изменений клеток (илл. 10), например, появление шистоцитов, наличие которых указывает на фрагментацию (разрушение) эритроцитов (илл. 9). Также у прибора нет возможности оценить наличие молодых форм эритроцитов, а именно ядерных: рубрицитов (нормоцитов) и рубрибластов (нормобластов). Данные клетки могут дать прогностическую подсказку в оценке воспалительной реакции, однако анализатором они считаются в лейкоцитарный росток. А ещё опытный лаборант при рутинном исследовании окрашенного мазка крови может заподозрить наличие телец Хейнца (также известных как тельца Хайнца или Гейнца-Эрлиха, илл. 11) и провести дополнительное окрашивание.
При подсчёте ретикулоцитов, аппараты не дифференцируют агрегатные (илл. 12) и пунктатные формы клеток, а ведь это у ряда видов животных является важным параметром (для оценки наличия регенераторного ответа).
 |
 |
| Илл. 9. Морфологические изменения эритроцитов: шистоциты, выраженная гипохромия | Илл. 10. Тельца Жолли |
 |
 |
| Илл. 11. Тельца Хейнца, специализированная окраска | Илл. 12. Ретикулоциты |
Выводы
- Для оценки общего анализа крови в ветеринарии необходимо использование специализированного оборудования и видоспецифичных профилей.
- Ни один современный анализатор не может полностью заменить микроскопию окрашенного мазка крови, необходима оценка лейкограммы ручным подсчётом, включающая оценку морфологии клеток.
СВМ № 2/2024
