Алексей Калиновский, главный ветеринарный врач Ветеринарного центра «Аргос-Клиник», г. Одинцово
Данная публикация является одной из немногих статей, посвящённых использованию клеточно-регенеративной терапии в ветеринарной медицине в России. На протяжении пяти лет мы предпринимаем попытки внедрить этот метод в повседневную практику ветеринарных врачей, но наталкиваемся на полное неприятие проблемы. Мне кажется, что на то есть две основные причины. Первая — консерватизм мышления врачей. И это давно знакомое явление. До сих пор многие врачи искренне не понимают, зачем нужен даже такой метод диагностики, как эндоскопические исследования. А в случае с клеточно-регенеративной терапией просто рушатся устоявшиеся понятия о лечении. Как сказал мне один из наших ведущих ортопедов: «Это всё прекрасно, но ты оставляешь нас без бизнеса и без денег». Отчасти это так, ибо смещаются акценты в лечении, и значительная часть лечебного процесса перемещается из операционной в лабораторию, но, с другой стороны, это дополнительный инструмент, причём новейший, в руках специалиста. Вторая проблема — банальное непонимание происходящего в организме. Да, очень сложно принять на веру то, что нельзя пощупать или увидеть глазами. Сейчас у врачей модно, как мантру, повторять присказку о «доказательности» ветеринарии. Естественно, доказывать надо, и это всегда делается. Но когда меня на лекции спрашивают: «…а как вы докажете всё, что говорите?», я всегда отвечаю, что нам доказывать уже ничего не надо. Всё уже доказано ведущими университетами мира, и надо просто взять их результаты и опыт. В наших условиях всё равно невозможно провести нормальные предклинические и клинические испытания, так как на это требуется много денег и соответствующие оборудование и условия. А ещё такие вопросы подтверждают, что, к сожалению, российские врачи имеют ограниченный доступ к мировой научной информации и часто «изобретают велосипед». Мы же предпочитаем внедрять в практику то, что уже изобретено и доказано, и не тратить зря время и деньги.
Возможности стволовых клеток безграничны, и поэтому в мире их всё шире и шире используют как в ветеринарной медицине, так и в медицине человека. В этой статье описывается применение метода регенеративной терапии только при лечении ОА, так как результаты видны невооружённым глазом, и даже скептики меняют своё мнение.
Хромота — одна из самых распространённых проблем, с которой приходится сталкиваться ветеринарным клиницистам в своей ежедневной практике. Статистика говорит, что эта патология более характерна для собак старшего возраста, но всё чаще и чаще появляется информация о развитии хронической хромоты у молодых собак. Словом, хромота молодеет.
Среди множества причин, вызывающих хромоту, одной из основных являются остеоартрозы (ОА) различной этиологии. В настоящее время лечение ОА является паллиативным. Существующие методы не решают задачи, не приводят к полному выздоровлению, а именно к восстановлению гиалинового хряща. Применение НПВС, хондропротекторов, протезов синовиальной жидкости, эндопротезирование суставов — всё это приносит временное облегчение состояния животного. На сегодняшний день единственным методом, который максимально приближает врачей к решению этой проблемы, а очень часто и решает её, является метод клеточно-регенеративной терапии (КРТ), а именно применение стволовых клеток для лечения ОА.
Открытие в 1908 году русским гематологом А. Максимовым стволовых клеток (СК) и их дальнейшие исследования позволили получить данные об уникальных биологических способностях этих клеток.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — это ядросодержащие недифференцированные мультипотентные клетки веретенообразной формы, которые могут быть выделены из таких тканей взрослого организма, как костный мозг, жировая ткань и т. д., способные дифференцироваться в костную, хрящевую, жировую и мышечную ткани, а также самовоспроизводиться через деление.
В настоящее время для более точной классификации в научной литературе тех клеток, которые способны дифференцироваться в различные типы тканей и способны к длительному самовоспроизведению, Международное общество клеточной терапии (International Society of Cellular Therapy) предложило к употреблению термин «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (ММСК). Этот факт особенно актуален для ветеринарной медицины, поскольку необходимо учитывать клеточную видоспецифичность у животных.
ММСК обладают функциями, необходимыми для восстановительной терапии. Это:
• противовоспалительная/иммуномодулирующая функция;
• трофическая функция;
• способность к дифференциации;
• хоуминг (самонаведение, хемотаксис);
• реваскуляризация;
• анти-апоптоз;
• кондиционирование — создание благоприятных условий для дифференциации резидентных клеток.
Для осознания безопасности применения стволовых клеток при лечении разных патологий у животных необходимо уяснить, что существуют:
• эмбриональные клетки (до имплантации в стенку мат-
ки) — в практике не используются, т. к. обладают высокой степенью тератогенности;
• фетальные — с момента имплантации и до рождения. Получение этих клеток затруднено, но возможно. Мы делаем это при проведении овариогистерэктомии на поздних сроках беременности у животных;
• постнатальные — получаемые в момент рождения из пуповинной крови (но в ветеринарии это возможно только в коневодстве) и клетки взрослого организма.
Следовательно, из существующих видов стволовых клеток только эмбриональные вызывают риск образования опухолей при введении в организм. Зато эмбриональные клетки являются плюрипотентными и из них закладываются все органы и ткани как организма человека, так и организма животного.
Метод клеточно-регенеративной терапии уже стал рутинным в практике ветеринарных врачей Северной Америки, Европы, Австралии и других развитых стран. Вопрос всегда только в финансовых возможностях владельца и в его вере в передовые технологии. Кстати, консерватизм (как российских врачей, так и владельцев животных) тормозит развитие не только метода КРТ, но и других инноваций в ветеринарии.
Итак, наиболее актуальными источниками получения ММСК в организме являются костный мозг (КМ) и жировая ткань (ЖТ). Доказано: клетки, полученные из КМ и ЖТ, не отличаются друг от друга ни по способности к дифференциации, ни по проявленной биологической активности in vitro. Однако опыт с одинаковыми по объёму образцами ЖТ и КМ показал, что в образце ЖТ содержится в 2 500 раз больше интересующих нас клеток, да и получение самого пунктата КМ у собак является достаточно сложной процедурой, сопряжённой с наркозом, и может вызвать осложнения.
В нашей практике применяется метод клеточно-регенеративной терапии, в котором используются как аутологичные (т. е. собственные клетки животного), так и аллогенные (клетки другого животного того же вида) ММСК, полученные из ЖТ.
Перед тем как приступить к лечению животного стволовыми клетками, необходимо убедиться, что у него нет острых вирусных или инфекционных заболеваний, а также злокачественных новообразований. Новообразования являются абсолютным противопоказанием для применения метода КРТ.
Для получения материала ЖТ животное фиксируют в положении сидя или на боку. В залопаточной области, с соблюдением всех правил, готовится операционное поле. Проводится послойная внутрикожная и подкожная анестезия, затем делается вертикальный кожный разрез размером 1–1,5 см. Через произведённый разрез берут кусок подкожной жировой клетчатки объёмом 1–1,5 см3. Взятый кусок ЖТ помещают в пробирку с транспортной питательной средой. Также у животного из вены берут 10–15 мл крови. Жировая ткань и кровь поступают в лабораторию. В течение
2–3 недель из полученного образца жировой ткани выделяют ММСК, количество которых наращивается до необходимой терапевтической дозы. На собаку весом 35–40 кг мы применяем терапевтическую дозу в количестве 5 млн клеток, помещённых в 1 мл смеси питательной среды и сыворотки крови. Эта доза поступает в клинику из лаборатории в одноразовом шприце, уже готовая к употреблению.
Готовую суспензию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток вводят непосредственно в поражённый сустав.
Оставшиеся после культивирования клетки замораживают и хранят в банке клеток при температуре –196°С. При необходимости эти клетки размораживают, и в течение 2–3 дней они готовы для использования.
До сих пор до конца не изучен механизм, ответственный за положительный эффект, который оказывают ММСК, попав в сустав. Один из возможных путей — секреция ММСК-ЖТ собаки антагониста рецептора (IL-1ra) интерлейкина-1 (IL-1). Известно, что IL-1 играет значительную роль в болезнях суставов многих животных. Доказано, что угнетение IL-1 его ингибитором IL-1ra оказывает положительное воздействие на сустав лошадей при лечении ОА. Можно предположить, что такое же воздействие IL-1ra оказывает и в суставах собак. Не следует забывать хорошо изученный факт, что ММСК, помимо способности к собственно дифференциации, обеспечивают регенерацию поражённых тканей за счёт доставки и секреции цитокинов и факторов роста. Поэтому можно представить, что, попав в синовию поражённого сустава, ММСК начинают стимулировать регенерацию резидентных клеток.
Итак, попав в поражённый орган, ММСК «считывают» биохимическую информацию о своём местоположении и определяют алгоритм своего действия. В суставе стволовые клетки оказывают противовоспалительную функцию, прерывают нежелательный апоптоз, стимулируют резидентные клетки к регенерации, а также дифференцируются в хондроциты, образуя гиалиноподобную массу.
Для доказательства данной теории в Госпитале Национального Университета Сингапура был проведён эксперимент на кроликах. 37 животным под наркозом был нанесён дефект гиалинового хряща медиального мыщелка бедренной кости. Дефект был размером 6×3×1 мм. В левый коленный сустав всех кроликов была введена суспензия ММСК, полученных из ЖТ, правый сустав был оставлен как контрольный. Животных выводили из эксперимента соответственно на 2-й, 6-й, 12-й и 24-й неделях. На представленных слайдах показана динамика восстановления дефекта гиалинового хряща и заполнение его гиалиноподобной массой.
С 2010 года нами было пролечено 18 животных с остеоартрозами и хромотой различной этиологии. Видимые улучшения наступали на 3–4-й неделе после введения суспензии ММСК. Только в двух случаях потребовалось повторное введение в интервале 4–6 недель, и одна собака (кобель породы южноафриканский бурбуль) требует ежегодного введения клеток. У остальных животных рецидивы ОА не отмечаются.
Возможности ММСК поистине безграничны. Это:
• остеоартрозы неинфекционного генеза — первичные или идиопатические, вторичные, дисплазии, травмы;
• несрастающиеся переломы;
• при проведении остеосинтеза и артроскопии;
• при оскольчатых переломах;
• асептический некроз головки бедренной кости;
• сочетанное применение при использовании костнозамещающих материалов;
• спинальные травмы;
• при невозможности применения НПВС и других существующих методов лечения;
• травмы связок и сухожилий;
• обширные повреждения мягких тканей после лучевых, химических и термических ожогов;
• гангрены.
Можно бесконечно долго рассуждать об успехах и перспективах метода клеточно-регенеративной терапии. Но лучше всего об этом говорят результаты опроса владельцев животных, страдающих от ОА и пролеченных методом клеточно-регенеративной терапии. Этот опрос проводила компания Vet-Stem (Сан-Диего, Калифорния), основательница этого метода. У 81% пролеченных животных состояние значительно улучшилось, у 12% изменений не отмечалось и только у 7% состояние ухудшилось. 85% владельцев животных сказали, что они будут рекомендовать метод клеточно-регенеративной терапии владельцам других больных животных. А не это ли лучшая оценка работы ветеринарного врача?
Применение стромально-васкулярной фракции жировой ткани при лечении внутрисуставного перелома
В марте 2013 года в Ветеринарный центр «Аргос» была доставлена собака метис, сука, возраст 6 месяцев, по кличке Анфиса.
Со слов владельца, в игре Анфису сбила большая собака, после чего Анфиса перестала наступать на левую тазовую конечность. При осмотре собака также не наступала на неё. При пальпации в области коленного сустава отмечалась ярко выраженная болевая реакция. Попытки принудительно согнуть и разогнуть конечность в коленном суставе вызывали сильную боль, а амплитуда движений сустава была ограничена.
После проведения рентгенологического обследования был поставлен диагноз — отрыв апофиза большеберцовой кости со смещением плато большеберцовой кости и переломом малой берцовой кости (фото 1).
 |
 |
|
Фото 1. Рентгенография левой тазовой конечности пациентки при поступлении в «Аргос-Клиник» |
Фото 2. Контрольная рентгенограмма через 7,5 мес. после операции и введения стромально-васкулярной фракции жировой ткани в полость сустава |
Данный перелом требовал проведения остеосинтеза с целью репозиции обломков в анатомически правильное положение, их фиксации и попытки восстановления подвижности сустава. Операцию необходимо было провести в максимально сжатые сроки. Из-за сомнений владельцев операция была сделана через неделю после постановки диагноза.
Под наркозом животному была проведена латеральная продольная артротомия повреждённого сустава. После ревизии суставной полости выяснилось, что за неделю началось активное образование костной мозоли и обломки уже невозможно вернуть в анатомически правильное положение.
Из сустава были эвакуированы мелкие обломки хрящевой и костной ткани. Гиалиновый хрящ в результате перелома значительно пострадал. Было принято решение не трогать зафиксированные обломки, операционную рану зашить, в полость сустава ввести стромально-васкулярную фракцию жировой ткани с целью купирования воспаления и восстановления целостности гиалинового хряща.
Для этого в залопаточной области у животного мы взяли 5 г подкожного жира и 10 мл крови в биохимическую пробирку. Жир был помещён в пробирку с питательной транспортной средой и с курьером отправлен в лабораторию Центра ветеринарной клеточной медицины. В течение полутора часов доставленный жир был обработан, и из него было получено 12 млн клеток стромально-васкулярной фракции. Эти клетки были помещены в 1 мл специальной питательной среды, смешанной с сывороткой крови животного, и доставлены в клинику. Суспензия клеток была введена непосредственно в повреждённый сустав.
Послеоперационный уход осуществлялся как обычно после проведения остеосинтеза. На 10-й день были сняты швы, и животное было отправлено домой без каких-либо ограничений в содержании.
Через 7,5 месяцев был проведён контрольный осмотр животного. При осмотре — хромота отсутствует. Движения свободные. Животное свободно передвигается любым аллюром, прыгает. При пальпации болезненность в области левого коленного сустава полностью отсутствует. Принудительно сустав сгибается и разгибается полностью. Контрольная рентгенограмма показала полную консолидацию обломков внутри сустава (фото 2).
Данный клинический случай подтверждён видеосъёмкой, которая находится на сайте ветеринарного центра «Аргос-Клиник»: http://vetargos.ru/category/articles-video.
Литература
1. Agung M, Ochi M, Yanada S, Adachi N, Izuta Y, Yamasaki T, Toda K. (2006) Mobilization of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into the injured tissues after intraarticular injection and their contribution to tissue regeneration. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 14:1307–1314.
2. Brehm W, J Burk, U Delling, C Gittel and I Ribitsch. (2012). Stem cell-based tissue engineering in veterinary orthopaedics. Cell Tissue Res 347:677–688.
3. Black LL, Gaynor J, Gahring D, Adams C, Aron D, Harman S, Gingerich DA, Harman R (2007). Effect of adipose-derived mesenchymal stem and regenerative cells on lameness in dogs with chronic osteoarthritis of the coxofemoral joints: a randomized, double-blinded, multicenter, controlled trial. Vet Ther 8(4):272–284.
4. Black LL, Gaynor J, Adams C, Dhupa S, Sams AE, Taylor R, Harman S, Gingerich DA, Harman R (2008). Effect of intraarticular injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem and regenerative cells on clinical signs of chronic osteoarthritis of the elbow joint in dogs. Vet Ther 9(3):192–200.
5. Crovace A, Staffieri F, Rossi G, Francioso E (2009). Implantation of autologous bone marrow mononuclear cells as a minimal invasive therapy of Legg-Calve'-Perthes' disease in the dog. In: World Conference on Regenerative Medicine. Regen Med Suppl, Vol.4, No.6 (Suppl.2), Nov 2009. Ref Type: Conference Proceeding.
6. Kim EH and CY Heo. (2014). Current applications of adipose-derived stem cells and their future perspectives. World J Stem Cells 6:65–68.
7. Nathan et al. Cell-based therapy in the repair of osteochondral defects:A novel use for adipose tissue. Tissue Engineering, 2003.
8. Reich CM, Raabe O, Wenisch S, Bridger PS, Kramer M, Arnhold S (2009). Comparison of canine adipose and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. In: World Conference on Regenerative Medicine. Regen Med Suppl,Vol.4, No.6 (Suppl. 2), Nov 2009. Ref Type: Conference Proceeding.
СВМ № 5/2015