Новые возможности в характеристике и переносе NK-клеток в иммунотерапии собак

Аннотация

Интерес к онкологической иммунологии и её клиническому применению резко возрос в связи с открытием лекарственных средств, нацеленных на иммунные клетки, что часто приводит к впечатляющим противоопухолевым эффектам. Тем не менее, успешная клеточная иммунотерапия солидных опухолей остаётся сложной задачей. Применение иммунотерапии у собак с естественными формами рака стало перспективной моделью для крупных животных, позволяющей решить проблемы, связанные с иммунотерапией, в том числе с использованием естественных киллеров (NK-клеток). Здесь мы рассмотрим последние достижения в области характеристики и понимания работы NK-клеток у собак, что является важным трамплином для будущих исследований в области трансляционной NK-иммунотерапии. Характеристика NK-клеток собак исключительно актуальна, учитывая текущие проблемы с их определением и контекстуализацией их сходств и различий по сравнению с NK-клетками человека и мыши, которые усугубляются ограниченной доступностью проверенных реагентов, специфичных для собак. Кроме того, мы обобщаем текущий обзор клинической нашей и переведённой литературы, в которой используются стратегии, позволяющие использовать эндогенную и экзогенную иммунотерапию NK-клетками у собак с раком. Полученные в ходе этих исследований данные об эффективности и иммунных коррелятах обеспечивают прочную основу для разработки и тестирования новых комбинированных методов лечения, направленных на повышение активности NK-клеток, а также стимулируют сравнительную работу по распространению этих результатов на раковые заболевания человека, имеющие большое сходство с их аналогами у собак. Обобщение знаний, начиная с базового фенотипа и функций NK-клеток у собак и заканчивая их применением в клинических испытаниях, проводимых на собаках впервые, дополнит модель рака у этих животных и улучшит трансляционную работу по улучшению результатов лечения рака как у собак, так и у людей.

Ключевые слова: NK-клетки, собаки, иммунотерапия, клинические испытания, маркеры.

Введение

Появление иммунотерапии вывело онкологию за рамки стандартных методов лечения, таких как хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Хотя подавляющее большинство успешных методов иммунотерапии на сегодняшний день фокусируются на использовании Т-клеток (такие как ингибирование PD-1/PD-L1 и CAR-T-клеток), такие стратегии не всегда успешны у всех пациентов. Таким образом, исследователи расширили сферу своей деятельности, чтобы использовать другие типы иммунных клеток и манипулировать ими. Одним из наиболее перспективных кандидатов стали естественные клетки-киллеры (NK), учитывая их врождённую цитотоксичность в отношении широкого спектра мишеней и мощную выработку цитокинов. NK-клетки считаются стражами врождённой иммунной системы, способными идентифицировать и уничтожать инфицированные вирусом и трансформированные раком клетки с помощью механизмов, которые не требуют антигенспецифического распознавания.

NK-клетки были объектом потенциальной терапии на протяжении десятилетий, начиная с первых исследований, проведённых Розенбергом и соавторами в 1980-х годах, и многих других [1–3]. Однако при первых попытках была отмечена серьёзная токсичность, в основном из-за усиления цитотоксической реакции лимфоцитов и сопутствующего применения высоких доз IL-2 для поддержки адоптивного переноса этих клеток пациентам. Эти результаты подчёркивают необходимость минимизации таких реакций при одновременном использовании противоопухолевых эффектов NK-клеток. Собаки-компаньоны стали полезной моделью для изучения новых методов лечения рака, учитывая, что собаки — это крупный вид животных, у которого спонтанно развивается рак в условиях неповреждённой иммунной системы. В частности, для изучения NK-клеток модель на собаках имеет неоценимое значение, поскольку позволяет оценить сложную взаимосвязь между развитием неоплазии и функционированием иммунной системы. Здесь мы рассмотрим недавние испытания иммунотерапии у собак, в которых применялось прямое или косвенное воздействие с помощью NK-клеток, а также кратко расскажем о достигнутом прогрессе и препятствиях, которые всё ещё существуют на пути продвижения методов NK-иммунотерапии у собак.

Идентификация и описание NK-клеток собак

Популяции лимфоидных клеток врождённого иммунитета (ILC) широко изучались у людей и мышей на протяжении десятилетий. В сравнении с ними у собак ILC менее изучены, хотя в последнее время проводились исследования, направленные на углубление нашего понимания [4]. Идентификация и изучение популяций NK-клеток у собак на основе поверхностных маркеров были объектом продолжительной работы многих групп учёных [5–8]. Ранние исследования установили, что маркеры CD4-/CD20- являются у собак маркерами Т- и В-клеток соответственно [9]. Подробный обзор, касающийся эволюции коллективного понимания идентификации NK-клеток у собак, был опубликован Гингричем и соавторами [10].

Подводя итог, можно сказать, что многие ранние исследования были сосредоточены на фенотипической идентификации NK-клеток собак с использованием поверхностных маркеров, поскольку эти маркеры отличаются от таковых у людей и мышей [10]. Huang с соавторами были первыми, кто описал NK-клетки собак, используя поверхностную плотность маркера CD5 — члена суперсемейства рецепторов-поглотителей, богатого цистеином и обычно классифицируемого как маркер Т-клеток [11]. В этом исследовании были отмечены важные различия в лимфоидном фенотипе, основанные на плотности CD5, поскольку клетки с экспрессией CD5dim были крупнее, содержали больше цитоплазматических гранул и демонстрировали антигеннезависимую цитотоксичность, особенно в условиях насыщения IL-2 [11].

Дальнейшие исследования, проведённые Шином и соавторами, по-прежнему были сосредоточены на плотности рецептора CD5 как маркера NK, в частности, на сравнении CD3+CD5dimCD21- с CD3+CD5-CD21-клетками [12]. После размножения и совместного культивирования с питающими клетками K562 и цитокинами в течение 21 дня клетки, экспрессирующие CD5dim, не экспрессировали ни TCRaP, ни TCRyS [12]. Кроме того, CD3+CD5dimCD21- клетки демонстрировали значительно более высокую продукцию цитокина IFN-γ по сравнению с CD3+CD5-CD21- [12]. Основываясь на этих результатах, авторы предположили, что каждая популяция представляет собачьи NK-клетки на разных уровнях созревания [12], хотя стадии созревания и развития собачьих NK-клеток остаются малоизученной темой, в отличие от ключевых открытий в исследованиях на мышах и людях [13–15].

Рецептор NK-клеток всех млекопитающих, NCR1/NKp46, также был идентифицирован как маркер NK-клеток собак [10]. Исследования, проведённые Grondahl-Rosado и соавторами, показали, что CD3-NCR1+ клетки у собак составляют 2,5% РВМС (мононуклеарных клеток периферической крови), что значительно ниже, чем доля NK-клеток, наблюдаемых у других млекопитающих [6; 7]. Фольц и соавторы разработали новое антитело к собачьему NKp46 для использования в проточной цитометрии [5]. В их работе также была выявлена подгруппа CD3-NKp46+ NK, представляющая приблизительно 2–3% РВМС [5]. Было обнаружено, что эти клетки обладают высокой цитотоксичностью в отношении нескольких линий рака у собак. Используя новую методику размножения, авторы также идентифицировали популяцию CD3+TCR+NKp46+ клеток [5]. Предполагалось, что CD3-позитивность NK-клеток собак отражает другую стадию созревания, хотя окончательная траектория их развития до настоящего времени не была описана [5; 10].

Совсем недавно Грудзиен и соавторы создали линию NK-клеток (CNK-89), полученную от собаки с NK-клеточной неоплазией [16]. Эта клеточная линия выражалась CD5+CD8+CD45+CD56+CD79a+NKp46+. Хотя CD79a является классическим маркером В-клеток, присутствие белка NKp46 и экспрессия мРНК NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 и перфорина свидетельствуют о наличии свойств NK-клеток в этой клеточной линии. После терапии с использованием IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21 наблюдалась повышенная экспрессия гранзима В, перфорина и CD16 [16]. Также была отмечена секреция TNFα и IFNγ. Эти результаты не наблюдались после терапии посредством IL-2, что позволяет предположить, что эти опухолевые клетки являются независимой от IL-2 клеточной линией и потенциально полезны для изучения альтернативных путей активации NK-клеток у собак [16].

Гингрич с соавторами провели подробный анализ дифференциальной экспрессии генов двух наиболее распространённых популяций NK-клеток собак: CD3-CD5dim и CD3-NKp46+ [17]. Заметные различия наблюдались в стационарных клетках, включая неопределяемую экспрессию мРНК гранзима В, перфорина, IFNγ и KLRD1/CD94 в клетках CD3-CD5dim, но определяемую экспрессию в клетках CD3+NKp46+ [17]. Примечательно, что после совместного культивирования с облучёнными питающими клетками человека (K562cl9, [18]) две клеточные популяции сходились по почти идентичному фенотипу экспрессии мРНК [17]. Полученные данные свидетельствуют о том, что каждая популяция, вероятно, содержит NK-клетки, отобранные для быстрого и доминантного роста в стимулирующих условиях совместного культивирования.

Затем авторы провели секвенирование одноклеточной РНК клеток CD3-CD5dim и CD3-NKp46+, прошедших активируемую флуоресценцией сортировку (FACS, специальный тип проточной цитометрии), чтобы исследовать совпадение между двумя популяциями. В этих исследованиях было обнаружено, что в стационарном состоянии популяция CD3-CD5dim является более гетерогенной, чем популяция CD3-NKp46+. Экспрессия генов, определяющая дисперсию в клетках CD5dim, была преимущественно связана с экспрессией генов, отличных от NKC, что подтверждает тот факт, что CD5dim, по-видимому, является менее специфичным маркером. Дальнейшие исследования отдельных клеток после активации двух их популяций в совместной культуре продемонстрировали консервативную траекторию активации, основанную на равномерных, незаметных изменениях экспрессии генов каноничных факторов транскрипции NK, а также заметных изменениях экспрессии гранзима A, IL2RB и KLRB1. Эти данные описывали переход как CD3-CD5dim, так и CD3-NKp46-NK-клеток собак из состояния покоя в активированное состояние, что может дать представление о стадиях созревания NK-клеток у собак — физиологическом процессе, который ещё предстоит чётко объяснить.

В целом точная идентификация популяций NK-клеток собак остаётся труднодостижимой, вероятно, отчасти из-за недостаточного понимания процесса созревания, а также вариабельной экспрессии генов и поверхностных белковых маркеров, связанных с различными стадиями развития. Однако, основываясь на приведённых выше исследованиях, у собак было продемонстрировано существование популяций лимфоцитов врождённого иммунитета, способных к цитокинзависимой, антигеннезависимой цитотоксичности, что открывает путь для клинического применения иммунотерапии на основе NK у собак.

NK-клетки в иммунотерапии у собак

В конечном счёте, иммунотерапия должна быть протестирована на иммунокомпетентных хозяевах. Это подчёркивает силу модели собаки, особенно когда новые методы иммунотерапии сочетаются с серийными иммунными коррелятами [19]. Изучение иммунных популяций до, во время и после иммунотерапии может не только дать представление о наличии или отсутствии клинической пользы в соответствующем исследовании, но и может быть использовано для выработки гипотез в целях повышения эффективности. Кроме того, иммунные корреляты могут выявить потенциальные биомаркеры реакции, что приведёт к улучшению отбора собак, которые с большой вероятностью будут реагировать на лечение, и выявлению подгрупп собак-пациентов, которым требуются инновационные вмешательства. Совместные усилия по объединению уроков, извлечённых из завершённых или продолжающихся клинических испытаний на собаках, необходимы для будущего этой области. На сегодняшний день завершено несколько испытаний иммунотерапии на собаках, которые показали прямое или косвенное воздействие на предполагаемые популяции NK-клеток. В испытаниях использовались адоптивная клеточная терапия, цитокиновая терапия, вирусотерапия, радио- и химио-иммунотерапия и точечная блокада для лечения собак со спонтанным раком с использованием различных методов идентификации и анализа NK-клеток (илл. 1 и таблица 1).

Илл. 1. Завершённые на сегодняшний день, текущие и потенциальные собачьи NK-маркеры и клинические испытания на собаках, связанные с коррелятами NK-клеток. Создано с помощью BioRender.com

Таблица 1. Клинические испытания на собаках с выявлением коррелятов NK-иммунитета

Наша группа завершила несколько первых испытаний с использованием адоптивного переноса NK-клеток для лечения собак со спонтанным раком. В 2017 году мы лечили собак с нерезектабельной остеосаркомой конечностей (OSA) с помощью паллиативной лучевой терапии (ЛТ) и двух внутриопухолевых инъекций аутологичных NK-клеток [20]. NK-клетки были получены из PBMC с дефицитом CD5 в течение 14 дней совместного культивирования с облучёнными питающими клетками K562-C9-mIL 21 и рекомбинантным человеческим IL-2 в дозе 100 МЕ/мл [21]. После лечения мы наблюдали значительное увеличение количества CD45+GZMB+ клеток в PBMC с помощью проточной цитометрии, что свидетельствует о системных иммунных эффектах лечения, хотя, по-видимому, не было связи (илл. 1) между выживаемостью и количеством GZMB+ или IFNγ+ клеток в периферической крови [30]. Учитывая внутриопухолевый путь введения, мы также проанализировали биоптаты опухоли методом проточной цитометрии и обнаружили, что примерно 50% внутриопухолевых CD45+-клеток оказались положительными на внутриклеточную метку красителя, что согласуется с сохранением адоптивно перенесённых NK-клеток в течение одной недели после переноса в микроокружении опухоли (TME) [20]. Мы проанализировали опухолевую ткань методом ПЦР в реальном времени и показали, что экспрессия генов сильно варьировалась в зависимости от пациента, при этом не было различий в экспрессии генов у собак, которые были живы или умерли через 6 месяцев [30]. Однако интересно отметить, что у самой долгоживущей собаки, срок выживания которой составил 18 месяцев, наблюдалось наибольшее изменение экспрессии генов CD3, CD8 и IDO1 после лучевой терапии и внутриопухолевого переноса NK [30].

Иммунотерапия также может стимулировать эндогенные NK-клетки с помощью цитокинов, которые отвечают за активацию, миграцию и размножение NK-клеток in vivo. Наша группа также завершила первое исследование по увеличению дозы у собак с метастатической меланомой в лёгких и остеосаркомой с использованием ингаляционного рекомбинантного человеческого IL-15 для стимуляции NK-клеток в лёгких в местах метастазирования [31]. Семь из первоначальных участников также были проанализированы в ходе предварительной оценки периферических NK-клеток с помощью проточной цитометрии и секвенирования РНК [17; 22]. Доля общих NK-клеток и NK-клеток, экспрессирующих Ki67, увеличивалась во время ингаляционного лечения IL-15 и приводила к значительному увеличению количества гранзима В в несколько раз [22]. И наоборот, имелись свидетельства усиления экспрессии гена TIGIT — ингибирующего маркера — как на 7-й, так и на 14-й день терапии [22]. Увеличение содержания как гранзима В, так и TIGIT свидетельствует об одновременной стимуляции активирующих и ингибирующих путей, баланс которых потенциально определяет реакцию на лечение. Секвенирование РНК PBMC пациентов даёт предварительные доказательства того, что активирующий/ингибирующий баланс может быть специфичным для конкретного пациента, поскольку дисперсия в анализе главных компонентов (PCA) была обусловлена в основном двумя собаками, которые ответили на лечение [17]. По завершении исследования, в общей сложности среди 21 собаки, мы наблюдали клиническую пользу в 39% случаев [31]. Цитотоксичность PBMC пациентов по отношению к мишеням остеосаркомы (OSA) и меланомы (M5) значительно повышалась от начала терапии к её завершению, а максимальная цитотоксичность достоверно коррелировала с выживаемостью пациентов [31]. Обнаружение повышенной цитотоксичности периферической крови у всей когорты пациентов после лечения позволяет предположить, что происходит гибель опухолевых клеток, но это приводит к улучшению выживаемости только у некоторых пациентов.

Существует множество методов иммунотерапии, которые традиционно не нацелены на NK или носят неспецифический характер, но всё же приводят к активации NK, что делает их привлекательными кандидатами для мультимодального лечения [23; 32]. Например, онколитические вирусы являются уникальным видом иммунотерапии в том смысле, что их основной функцией является проникновение и размножение в раковых клетках, что приводит к лизису, но вскоре было признано, что этот процесс также повышает иммуногенность раковых клеток, что приводит к привлечению и элиминации иммунных клеток. Это аналогичный механизм, с помощью которого вирусы, такие как вирус мозаики коровьего гороха, используются в качестве терапии для связывания неспецифических рецепторов и стимуляции индукции иммунного ответа в организме.

Мартин-Карраско с соавторами протестировали внутриопухолевый онколитический вирус на основе собачьего аденовируса дикого типа, который был сконструирован для селективной репликации в мутировавших клетках для лечения больных раком собак [24]. Преимуществом исследования было наличие серийных проб, взятых у пациентов до и в течение одного года после лечения. По крайней мере, у четырёх из восьми пациентов наблюдалось увеличение количества NK-клеток в периферической крови в течение первого месяца после лечения, что было оценено с помощью проточной цитометрии [24]. Однако в качестве идентифицирующего маркера был использован CD56, который, как известно, не экспрессируется на NK-клетках собак, что подчёркивает важность проверки как используемых реагентов, так и лежащей в их основе биологии, учитывая значительные межвидовые различия в NK-клетках.

В другом исследовании авторы лечили олигодендроглиому и астроцитому собак с помощью внутриопухолевых инъекций M032 — генетически модифицированного вируса простого герпеса. Авторы наблюдали обогащение сигнатур генов мРНК опухоли, ассоциированных с NK-клетками, у четырёх из шести пациентов, у которых были доступны образцы [25]. В этом исследовании генные сигнатуры NK-клеток были помечены как принадлежащие «клеткам NK CD56dim» и проанализированы с помощью панели экспрессии генов NanoString Technologies [25]. Классификация NK-клеток как CD56dim с помощью этого метода описана как основанная на экспрессии IL21R при анализе почти 10 000 образцов из Атласа генома рака (TCGA) [26]. Таким образом, хотя CD56 или CD56D’m не подтверждены в качестве собачьих NK-маркеров, считается, что IL21R экспрессируется на собачьих NK-клетках и способен активироваться соответствующим лигандом IL-21.

Тот же метод иммунного профилирования был использован для изучения количества NK-клеток в TME собак с воспалительным раком молочной железы, получавших внутриопухолевую иммунотерапию с использованием пустых частиц, подобных вирусу мозаики коровьего гороха (eCPMV) [27], которые распознаются toll-подобными рецепторами (TLR). Они не обнаружили существенных изменений в клетках, помеченных как «NK CD56dim-клетки», или клетках, обогащённых IL21R, а кратные увеличения других генов, связанных с NK-клетками, включая KLRA1, KLRD1 и GZMB, были обнаружены в обработанной опухолевой ткани, но незначительно [27]. И наоборот, в обработанной опухолевой ткани по сравнению с необработанной наблюдалось значительное повышение уровня IL18R1 и значительное снижение уровня IL12RB2, при том что оба они вовлечены в функции NK-клеток [27]. Это подтверждает закономерность иммунотерапии собак, при которой одновременно наблюдаются как активация, так и ингибирование. В другом исследовании пациенты с раком молочной железы лечились с помощью eCPMV [33]. В этом исследовании проводились две инъекции в самую крупную опухоль с последующей её резекцией. В соответствии с результатами, полученными у собак, получавших только eCPMV, не было обнаружено дифференциальной экспрессии генов, связанных с NK, при использовании RNA-секвенирования для анализа образцов с опухолями, получавшими неоадъювантную иммунотерапию. Кроме того, для определения CD45+CD21-CD3-GZMB+ PBMCS в качестве NK-клеток использовали проточную цитометрию. Этот анализ показал незначительные изменения в периферических NK-клетках в ответ на eCPMV и хирургическое вмешательство [33].

Чтобы обойти препятствия, связанные с неоперабельными опухолями, и улучшить системные эффекты, аутологичные мезенхимальные стволовые клетки собак могут быть инфицированы собачьим онколитическим аденовирусом и введены пациентам. Это было выполнено на 27 собаках с экстракраниальным раком и оценено той же группой исследователей у 10 последующих собак с глиомами высокой степени злокачественности [34; 35]. В первоначальном исследовании количество периферических иммунных клеток, включая NK-клетки, увеличивалось после каждой дозы, хотя изменения не были статистически значимыми [34]. В последующем исследовании собаки с глиомами получали восемь еженедельных процедур клеточной виротерапии [35]. Используя CIBERSORT-анализ bulk-RNAseq опухолевой ткани, они обнаружили, что фракции NK-клеток после лечения не изменялись между пациентами, у которых наблюдался ответ на лечение, и теми, у кого он не наблюдался [35].

В совокупности эти методы лечения на основе вирусов показали предварительную эффективность у собак, но противоречивую связь с количеством NK-клеток и соответствующими генными сигнатурами в качестве биомаркеров клинических эффектов. Изменения в NK-клетках, скорее всего, будут обнаружены в TME, а не в периферической крови, особенно при внутриопухолевой иммунотерапии [28]. Эти исследования также выявляют реальные и продолжающиеся трудности в идентификации NK-клеток у собак, поскольку практически в каждом исследовании используются разные маркеры.

Будущее NK-иммунотерапии собак, вероятно, за комбинаторным подходом, который усиливает множество противоопухолевых методов. Несколько групп возглавили испытания комбинированной радиоиммунотерапии и химиоиммунотерапии у собак со спонтанным раком с различным вовлечением NK-клеток или родственных цитокинов и генов [29; 36].

Четыре собаки с запущенной стадией меланомы прошли курс тримодальной иммунорадиотерапии, которая включала субабляционную внешнюю лучевую терапию (EBRT), таргетную радионуклидную терапию (TRT) и внутриопухолевую иммуноцитокиновую терапию (IT-IC) [37]. Количество NK-клеток в циркулирующей крови, определённое методом проточной цитометрии с использованием CD3-CD5dim, существенно не изменялось на фоне лечения [37]. Однако анализ RNA-seq опухолевой ткани собак до и после лечения показал значительное повышение уровня KLRA1, KLRB1, NCR3, IL18R1 и TNFα в определённые моменты времени [37]. Небольшой размер выборки не позволяет сделать выводы относительно результатов выживаемости, но может помочь в контекстуализации вклада NK-клеток в ответ на терапию.

Важность учёта иммунных изменений в рамках прогрессирования или выживания хорошо проиллюстрирована в неродственном исследовании, в котором приняли участие 18 собак с В-клеточной лимфомой, получавших химиотерапию доксорубицином, моноклональные антитела против CD20 и низкомолекулярный ингибитор [38]. Анализ аспиратов из лимфатических узлов с помощью RNA-seq показал, что гены, связанные с функцией NK, являются наиболее значимо активируемым набором генов у собак с низкой выживаемостью, но образцы были получены только в один момент времени, что ограничивает выводы относительно иммунных изменений в ответ на терапию [38]. Последовательный отбор проб лимфатических узлов пациента и отслеживание изменений в ответ на лечение помогли бы уточнить выводы исследования и выявить прогностические биомаркеры в дополнение к прогнозирующим.

Прогностические биомаркеры ответа были аналогичным образом изучены в ходе исследования, в котором лечили собак со злокачественной меланомой полости рта с использованием блокады контрольных точек [39]. Лаборатория Ohashi впервые начала терапию собак антителами к PD-L1 и на сегодняшний день завершила два клинических испытания [40–42]. Механизм анти-PD-L1-терапии основан на понимании того, что PD-L1 на опухолевых клетках связывается с PD-1 на Т-клетках, обеспечивая ингибирующий сигнал, который нарушает противоопухолевые функции Т-клеток. Что касается NK-клеток, то связывание антител против PD-L1 с PD-L1, экспрессируемыми на NK-клетках, может усилить активацию и эффекторную функцию [43]. Таким образом, лечение может как устранить ингибирование Т-клеток, так и усилить функцию NK-клеток. В то время как первоначальные публикации об испытаниях на собаках против PD-L1 не содержали иммунных коррелятов ответа, последующее исследование сывороточных биомаркеров, проведённое той же группой, показало, что общая выживаемость после лечения положительно коррелировала с низким уровнем PGE2, более высоким уровнем IL-2 и более высоким уровнем IL-12 в сыворотках до лечения, помогает определить ЦОГ-2 в качестве потенциальной мишени для будущих испытаний [39]. NK-клетки не были основным объектом исследования, но авторы отметили, что PGE2 способен подавлять функцию NK-клеток, а IL-12, как известно, необходим для высвобождения IFNγ NK-клетками — наиболее известными продуцентами воспалительного цитокина [39]. Эти исследования иллюстрируют потенциал клинических испытаний, которые послужат основой для будущих исследований, выявляющих собак с высоким исходным уровнем PGE2 в сыворотке крови в качестве кандидатов на добавление ингибитора ЦОГ-2. Учитывая успешную разработку антител к собачьим PD-1/L1, определение того, обнаружены ли эти и другие иммунные контрольные точки на собачьих NK-клетках, окажет глубокое влияние на потенциальные мишени и комбинаторные подходы. Взятые вместе, эти данные обеспечивают предварительную базу для будущих исследований комбинированной иммунотерапии NK для комплексного противоопухолевого эффекта.

Обсуждение

NK-иммунотерапия у собак развивается всё более быстрыми темпами благодаря увеличению объёма выборки и сотрудничеству между университетскими клиниками и специализированными центрами. На момент написания этой публикации в базе данных Американской ассоциации ветеринарной медицины (AVMA) по исследованиям здоровья животных перечислены пять исследований, в которых в настоящее время ведётся набор, и 35 — с завершённым набором, посвящённых поиску иммунотерапии у собак, больных раком. Исследования, проведённые в Университете Миннесоты, продемонстрировали повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) сконструированных человеческих NK-клеток, экспрессирующих рекомбинантный CD64, что открывает возможности для разработки сконструированных собачьих NK-клеток, обладающих аналогичными эффекторными возможностями [44]. Исследователи из Университета штата Огайо одновременно добились прогресса в попытке усовершенствовать адоптивные продукты NK-клеток для иммунотерапии собак путём импринтинга NK-клеток TGF-β во время размножения, чтобы преодолеть потенциальное ингибирование в TME [45]. Эта группа использует этот метод терапии NK-клетками, импринтируемыми TGFβ, в сочетании с химиотерапией карбоплатином для лечения собак с OSA в рамках продолжающегося клинического испытания I фазы. Наша собственная группа стремилась усовершенствовать продукт NK для собак, используя неэмульгированные PBMC от здоровых доноров для аллогенного переноса адоптивных NK-клеток. Эти работы обеспечивают инфраструктуру, с помощью которой можно манипулировать собачьими NK-клетками для повышения стойкости и эффективности в будущих испытаниях иммунотерапии. Вовлечённость разных организаций и быстрое продвижение инноваций в области NK-иммунотерапии собак свидетельствует о её признанном потенциале.

Анализируя недавние исследования с доступными коррелятами NK-клеток, мы начинаем выяснять сложную структуру ответов NK-клеток на лечение. В целом имеются свидетельства как активации, так и ингибирования NK-клеток при иммунотерапии собак с умеренным и неравномерным воздействием на пропорции NK-клеток, которые варьируются в зависимости от внутриопухолевого и периферического отбора проб. Сроки отбора проб также очень важны, учитывая, что корреляция между NK-клетками и улучшением реакции может быть отрицательной или положительной в зависимости от стадии лечения, что можно ожидать в контексте ограниченного периода полураспада NK-клеток. Для выяснения роли NK-клеток в иммунотерапии собак требуются дополнительные исследования с внутриопухолевым и периферическим иммунологическим контролем и адекватным охватом для оценки ответа. Современная литература ясно указывает на потенциальную перспективу нацеливания на NK-клетки, особенно в комбинированной терапии, которая принесёт пользу как собакам, так и людям, которым необходимы новые методы иммунотерапии.

Вклад авторов
AR: первоначальный вариант статьи, рецензирование и редактирование. AG: первоначальный вариант статьи, рецензирование и редактирование. CT: обзор и редактирование. RR: обзор и редактирование. WM: обзор и редактирование. MK: рецензирование и редактирование. RC: первоначальный вариант статьи, рецензирование и редактирование.

Финансирование
Авторы заявляют, что для исследования, авторства и/или публикации данной статьи была получена финансовая поддержка. Эта работа была поддержана V фондом «Победа над раком» T2021–016 (RC), NIH/NCI U01 CA224166–01 (RC), NIH/NCI T32 CA251007–01 (AR) и F30CA275317 (AR).

Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Литература

1. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, et al. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine- activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone. N Engl J Med. (1987) 316:889–97. doi: 10.1056/NEJM198704093161501.
2. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Leitman S, Chang AE, Ettinghausen SE, et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med. (1985) 313:1485–92. doi: 10.1056/NEJM198512053132327.
3. Myers JA, Miller JS. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. (2020) 18:85–100. doi: 10.1038/s41571–020–0426–7.
4. McDonough SP, Moore PF. Clinical, hematologic, and immunophenotypic characterization of canine large granular lymphocytosis. Vet Pathol. (2000) 37:637–46. doi: 10.1354/vp.37–6–637.
5. Foltz JA, Somanchi SS, Yang Y, Aquino-Lopez A, Bishop EE, Lee DA. NCR1 expression identifies canine natural killer cell subsets with phenotypic similarity to human natural killer cells. Front Immunol. (2016) 7:521. doi: 10.3389/fimmu.2016.00521.
6. Grondahl-Rosado C, Bonsdorff TB, Brun-Hansen HC, Storset AK. NCR1+ cells in dogs show phenotypic characteristics of natural killer cells. Vet Res Commun. (2015) 39:19–30. doi: 10.1007/s11259–014–9624-z.
7. Gr0ndahl-Rosado C, Boysen P, Johansen GM, Brun-Hansen H, Storset AK. NCR1 is an activating receptor expressed on a subset of canine NK cells. Vet Immunol Immunopathol. (2016) 177:7–15. doi: 10.1016/j.vetimm.2016.05.001.
8. Graves SS, Gyurkocza B, Stone DM, Parker MH, Abrams K, Jochum C, et al. Development and characterization of a canine-specific anti-CD94 (KLRD-1) monoclonal antibody. Vet Immunol Immunopathol. (2019) 211:10–8. doi: 10.1016/j. vetimm.2019.03.005.
9. Lin YC, Huang YC, Wang YS, Juang RH, Liao KW, Chu RM. Canine CD8 T cells showing NK cytotoxic activity express mRNAs for NK cell-associated surface molecules. Vet Immunol Immunopathol. (2010) 133:144–53. doi: 10.1016/j.vetimm.2009.07.013.
10. Gingrich AA, Modiano JF, Canter RJ. Characterization and potential applications of dog natural killer cells in Cancer immunotherapy. J Clin Med. (2019) 8:1802. doi: 10.3390/jcm8111802.
11. Huang YC, Hung SW, Jan TR, Liao KW, Cheng CH, Wang YS, et al. CD5-low expression lymphocytes in canine peripheral blood show characteristics of natural killer cells. JLeukoc Biol. (2008) 84:1501–10. doi: 10.1189/jlb.0408255.
12. Shin DJ, Park JY, Jang YY, Lee JJ, Lee YK, Shin MG, et al. Ex vivo expansion of canine cytotoxic large granular lymphocytes exhibiting characteristics of natural killer cells. Vet Immunol Immunopathol. (2013) 153:249–59. doi: 10.1016/j.vetimm.2013.03.006.
13. Freud AG, Caligiuri MA. Human natural killer cell development. Immunol Rev. (2006) 214:56–72. doi: 10.1111/j.1600–065X.2006.00451.x.
14. Freud AG, Yu J, Caligiuri MA. Human natural killer cell development in secondary lymphoid tissues. Semin Immunol. (2014) 26:132–7. doi: 10.1016/j.smim.2014.02.008.
15. Kim S, Iizuka K, Kang HS, Dokun A, French AR, Greco S, et al. In vivo developmental stages in murine natural killer cell maturation. Nat Immunol. (2002) 3:523–8. doi: 10.1038/ni796.
16. Grudzien M, Pawlak A, Kutkowska J, Ziolo E, Wysokinska E, Hildebrand W, et al. A newly established canine NK-type cell line and its cytotoxic properties. Vet Comp Oncol. (2021) 19:567–77. Epub 20210426. doi: 10.1111/vco.12695.
17. Gingrich AA, Reiter TE, Judge SJ, York D, Yanagisawa M, Razmara A, et al. Comparative immunogenomics of canine natural killer cells as immunotherapy target. Front Immunol. (2021) 12:670309. doi: 10.3389/fimmu.2021.670309.
18. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS, Phatarpekar PV, Kopp LM, Johnson JL, et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. (2012) 7: e30264. doi: 10.1371/journal.pone.0030264.
19. Park JS, Withers SS, Modiano JF, Kent MS, Chen M, Luna JI, et al. Canine cancer immunotherapy studies: linking mouse and human. J Immunother Cancer. (2016) 4:97. doi: 10.1186/s40425–016–0200–7.
20. Canter RJ, Grossenbacher SK, Foltz JA, Sturgill IR, Park JS, Luna JI, et al. Radiotherapy enhances natural killer cell cytotoxicity and localization in pre-clinical canine sarcomas and first-in-dog clinical trial. J Immunother Cancer. (2017) 5:98. doi:10.1186/s40425–017–0305–7.
21. Somanchi SS, Senyukov VV, Denman CJ, Lee DA. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (2011) 48:2540. doi: 10.3791/2540.
22. Judge SJ, Darrow MA, Thorpe SW, Gingrich AA, O’Donnell EF, Bellini AR, et al. Analysis of tumor-infiltrating NK and T cells highlights IL-15 stimulation and TIGIT blockade as a combination immunotherapy strategy for soft tissue sarcomas. J Immunother Cancer. (2020) 8: e001355. doi: 10.1136/jitc-2020–001355..
23. Sivori S, Della Chiesa M, Carlomagno S, Quatrini L, Munari E, Vacca P, et al. Inhibitory receptors and checkpoints in human NK cells, implications for the immunotherapy of Cancer. Front Immunol. (2020) 11:2156. doi: 10.3389/ fimmu.2020.02156.
24. Martm-Carrasco C, Delgado-Bonet P, Tomeo-Martm BD, Pastor J, de la Riva C, Palau-Concejo P, et al. Safety and efficacy of an oncolytic adenovirus as an immunotherapy for canine cancer patients. Vet Sci. (2022) 9:327. doi: 10.3390/ vetsci9070327.
25. Chambers MR, Foote JB, Bentley RT, Botta D, Crossman DK, Della Manna DL, et al. Evaluation of immunologic parameters in canine glioma patients treated with an oncolytic herpes virus. J Transl Genet Genom. (2021) 5:423–42. doi: 10.20517/ jtgg.2021.31.
26. Danaher P, Warren S, Dennis L, D’Amico L, White A, Disis ML, et al. Gene expression markers of tumor infiltrating leukocytes. JImmunother Cancer. (2017) 5:18. doi: 10.1186/s40425–017–0215–8.
27. Barreno L, Sevane N, Valdivia G, Alonso-Miguel D, Suarez-Redondo M, Alonso- Diez A, et al. Transcriptomics of canine inflammatory mammary cancer treated with empty cowpea mosaic virus implicates neutrophils in anti-tumor immunity. Int J Mol Sci. (2023) 24:14034. doi: 10.3390/ijms241814034.
28. Judge SJ, Murphy WJ, Canter RJ. Characterizing the dysfunctional NK cell: assessing the clinical relevance of exhaustion, anergy, and senescence. Front Cell Infect Microbiol. (2020) 10:49. doi: 10.3389/fcimb.2020.00049.
29. Nolan MW, Kent MS, Boss MK. Emerging translational opportunities in comparative oncology with companion canine cancers: radiation oncology. Front Oncol. (2019) 9:1291. doi: 10.3389/fonc.2019.01291.
30. Judge SJ, Yanagisawa M, Sturgill IR, Bateni SB, Gingrich AA, Foltz JA, et al. Blood and tissue biomarker analysis in dogs with osteosarcoma treated with palliative radiation and intra-tumoral autologous natural killer cell transfer. PLoS One. (2020) 15: e0224775. doi: 10.1371/journal.pone.0224775.
31. Rebhun RB, York D, Cruz SM, Judge SJ, Razmara AM, Farley LE, et al. Inhaled recombinant human IL-15 in dogs with naturally occurring pulmonary metastases from osteosarcoma or melanoma: a phase 1 study of clinical activity and correlates of response. J Immunother Cancer. (2022) 10: e004493. doi: 10.1136/jitc-2022–004493.
32. Maskalenko NA, Zhigarev D, Campbell KS. Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders. Nat Rev Drug Discov. (2022) 21:559–77. doi: 10.1038/s41573–022–00413–7.
33. Valdivia G, Alonso-Miguel D, Perez-Alenza MD, Zimmermann ABE, Schaafsma E, Kolling FW, et al. Neoadjuvant intratumoral immunotherapy with cowpea mosaic virus induces local and systemic antitumor efficacy in canine mammary cancer patients. Cell. (2023) 12:2241. doi: 10.3390/cells12182241.
34. Cejalvo T, Perise-Barrios AJ, Del Portillo I, Laborda E, Rodriguez-Milla MA, Cubillo I, et al. Remission of spontaneous canine tumors after systemic cellular viroimmunotherapy. Cancer Res. (2018) 78:4891–901. doi: 10.1158/0008–5472.CAN-17–3754.
35. Cloquell A, Mateo I, Gambera S, Pumarola M, Alemany R, Garcia-Castro J, et al. Systemic cellular viroimmunotherapy for canine high-grade gliomas. J Immunother Cancer. (2022) 10: e005669. doi: 10.1136/jitc-2022–005669.
36. Klingemann H. Immunotherapy for dogs: still running behind humans. Front Immunol. (2021) 12:665784. doi: 10.3389/fimmu.2021.665784.
37. Magee K, Marsh IR, Turek MM, Grudzinski J, Aluicio-Sarduy E, Engle JW, et al. Safety and feasibility of an in situ vaccination and immunomodulatory targeted radionuclide combination immuno-radiotherapy approach in a comparative (companion dog) setting. PLoS One. (2021) 16: e0255798. doi: 10.1371/journal. pone.0255798.
38. Dittrich K, Yildiz-Altay U, Qutab F, Kwong DA, Rao Z, Nievez-Lozano SA, et al. Baseline tumor gene expression signatures correlate with chemoimmunotherapy treatment responsiveness in canine B cell lymphoma. PLoS One. (2023) 18: e0290428. doi: 10.1371/journal.pone.0290428.
39. Maekawa N, Konnai S, Asano Y, Sajiki Y, Deguchi T, Okagawa T, et al. Exploration of serum biomarkers in dogs with malignant melanoma receiving anti-PD-L1 therapy and potential of COX-2 inhibition for combination therapy. Sci Rep. (2022) 12:9265. doi: 10.1038/s41598–022–13484–8.
40. Maekawa N, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Ikebuchi R, Izumi Y, et al. Immunohistochemical analysis of PD-L1 expression in canine malignant cancers and PD-1 expression on lymphocytes in canine oral melanoma. PLoS One. (2016) 11: e0157176. doi: 10.1371/journal.pone. 0157176.
41. Maekawa N, Konnai S, Takagi S, Kagawa Y, Okagawa T, Nishimori A, et al. A canine chimeric monoclonal antibody targeting PD-L1 and its clinical efficacy in canine oral malignant melanoma or undifferentiated sarcoma. Sci Rep. (2017) 7:8951. doi: 10.1038/s41598–017–09444–2.
42. Maekawa N, Konnai S, Nishimura M, Kagawa Y, Takagi S, Hosoya K, et al. PD-L1 immunohistochemistry for canine cancers and clinical benefit of anti-PD-L1 antibody in dogs with pulmonary metastatic oral malignant melanoma. NPJ Precis Oncol. (2021) 5:10. doi: 10.1038/s41698–021–00147–6.
43. Dong W, Wu X, Ma S, Wang Y, Nalin AP, Zhu Z, et al. The mechanism of anti- PD-L1 antibody efficacy against PD-L1-negative tumors identifies NK cells expressing PD-L1 as a cytolytic effector. Cancer Discov. (2019) 9:1422–37. doi: 10.1158/2159–8290. CD-18–1259.
44. Hullsiek R, Li Y, Snyder KM, Wang S, Di D, Borgatti A, et al. Examination of IgG Fc receptor CD16A and CD64 expression by canine leukocytes and their ADCC activity in engineered NK cells. Front Immunol. (2022) 13:841859. doi: 10.3389/ fimmu.2022.841859.
45. Foltz JA, Moseman JE, Thakkar A, Chakravarti N, Lee DA. TGFp imprinting during activation promotes natural killer cell cytokine hypersecretion. Cancers. (2018) 10:423. doi: 10.3390/cancers10110423.

Источник: Front. Vet. Sci. 11:1336158. © 2024 Razmara, Gingrich, Toedebusch, Rebhun, Murphy, Kent and Canter. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.

СВМ № 3/2024