Новые возможности репарации повреждений суставного хряща у лошадей

И. Пономарёв1, Д. Барневитц, К. Майер2, Д. Пауль1, М. Нойман1, И. Вилке1, М. Кочнева3
1 Исследовательский центр медицинской техники и биотехнологии, Бад Лангензальца, Германия;
2 Травматологическое отделение университетской клиники Гиссен, Германия;
3 Новосибирский аграрный университет, Россия

 

Ponomarev Igor, fzmb GmbH, Geranienweg 7, 99867 Bad Langensalza. 049-3603-833-183, iponomarev@fzmb.de

 

Ограниченные возможности саморегенерации травматических повреждений гиалинового хряща являются основной причиной развития артрозов у спортивных лошадей. Поиски оперативных методов решения данной проблемы привели к развитию нового направления, находящегося на стыке биотехнологии и медицины — тканевой инженерии. Апробированные и получившие достаточно широкое распространение в ортопедии инвазивные методы восстановления хрящевых повреждений постепенно начинают применяться и в ветеринарной практике лошадей. Основой метода является создание трёхмерных хрящевых трансплантатов in vitro и последующая их имплантация в область поражения хряща. Исходным клеточным материалом для изготовления трансплантатов являются хондроциты, изолированные из биоптата хрящевой ткани, полученной при артроскопии. Клетки, полученные после энзиматического гидролиза биоптата, размножают в монослойной культуре до необходимой концентрации, а затем переводят в трёхмерную форму. Для поддержания пространственной формы существования клеток суставного хряща in vitro применяют, как правило, различные резорбируемые матрицы-носители. Их изготавливают либо из синтетических полимеров молочной и/или гликолевой кислот, либо из органических материалов, например коллагена (I и III типов). Переведённые в трёхмерное состояние хондроциты возвращаются, таким образом, к своему исходному фенотипу, что является необходимым условием синтеза компонетов внеклеточного матрикса, а именно: коллагена II типа и протеогликанов. Культивирование хондроцитов на матрицах-носителях длится от трёх до четырёх недель. Однако эти материалы имеют и свои недостатки, а именно: не всегда полностью резорбируются или резорбируются неконтролируемо с повышением местного иммунитета (увеличение локального количества макрофагов), негомогенное распределение клеток в структуре матрицы-носителя, а в некоторых случаях и отсутствие механической стабильности трансплантата. Таким образом, качество изготовленного in vitro тканеинженерного трансплантата может существенно влиять на конечный результат восстановления повреждённого суставного хряща.

Исходя из этого, в FZMB был разработан способ создания трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения матриц-носителей [Ponomarev и Wilke, 2004]. Основой метода является создание плотного клеточного агрегата и его последующая механическая стимуляция в процессе культиврования. Таким образом удалось получить хондротрансплантаты до 2 см в диаметре и 2–3 мм в толщину, которые по своей природе являются полностью аутологичными для пациента, т.к. состоят из собственных клеток и продуктов их синтеза. Кроме того, фактором, повышающим качество хрящевого трансплантата, является то, что в процессе культивирования клеток к питательной среде обязательно добавляется аутологичная сыворотка крови животного.

В настоящей работе представлены результаты исследования по применению хрящевых конструктов без матриц-носителей при репарации повреждений коленного сустава, проведённого на лошадях породы «хафлингер» (Германия). Для изучения процессов восстановления гиалинового хряща были изготовлены хондротрансплантаты различных размеров (рис. 1 а). Имплантация конструктов в зону дефекта производилась по принципу press-fit, т.е. размер дефекта соответствовал размеру хрящевого конструкта (рис. 1 б). Для надёжности фиксации по линии контакта трансплантат-хрящ использовался фибриновый клей.

Животных подвергли эвтаназии через 1,5 года после имплантации. Были проведены макроскопические анализы (рис. 1 в, г) ткани de novo и изучены количественные показатели основных компонентов внеклеточного матрикса (коллагенов и протеогликанов) хондротрансплантатов до имплантации и после полутора лет в состоянии in vivo. Помимо этого, было проведено гистологическое исследование содержания коллагена и протеогликанов в конструктах и проанализировано распределение клеток и основных компонентов внеклеточного матрикса в хрящевом регенерате по сравнению с нативным хрящом.
 

а
б
в
г

Рис. 1. Размеры тканеинженерных конструктов, изготовленных без матриц-носителей (а); имплантация хрящевых регенератов по методу press-fit (б); макроскопический анализ регенератов спустя 1,5 года после операции (в); поперечный разрез демонстрирует приживляемость и степень заполнения дефекта хрящевым конструктом (г).

 

Проведённые биохимические исследования показали высокую степень сходства тканеинженерного хрящевого трансплантата с гиалиновым суставным хрящом. Содержание коллагена в конструкте до имплантации составляло 24%, а пртеогликанов 20% от нативной ткани. После эвтаназии были взяты для анализа пробы регенерата, контактной зоны регенерат-хрящ и близлежащего нативного хряща. Было установлено увеличение содержания протеогликанов в конструкте по сравнению с нативной тканью с 20% до 32%, в зоне контакта концентрация составила 85% в сравнении с близлежащим участком гиалинового хряща. Ещё более значительные количественные изменения произошли в содержании коллагена. Так, концентрация гидроксипролина в конструкте возросла с 24% до 103%, а на границе регенерат-хрящ составила 94% по сравнению с близлежащей нативной тканью.

Гистологический анализ хрящевых конструктов показал отчётливое окрашивание как на коллаген, так и на протеогликаны, а также равномерное распределение клеток во вновь синтезированном матриксе. Распределение макромолекул внеклеточного матрикса в конструкте соответствует таковому в нативном хряще, а именно: в поверхностной зоне отмечается увеличение доли коллагена, тогда как средняя зона более богата протеогликанами. Результаты макроскопического анализа демонстрируют отчётливую ассоциацию ткани хрящевого регенерата с нативным хрящом (рис. 1 в). При изготовлении дефекта его края были ровные, а спустя 1,5 года отмечается наличие неровностей на границе конструкт-хрящ, взимопрникновение компонентов хряща и имплантированного регенерата ткани. Увеличение концентраций протеогликанов и коллагена в хрящевых конструктах после полутора лет в состоянии in vivo также свидетельствуют о положительной динамике регенерации повреждений гиалинового хряща с помощью тканеинженерных хрящевых трансплантатов, изготовленных без применения матриц-носителей. Неполное восстановление тканевого дефекта объясняется биологией суставного хряща, а именно отсутствием васкуляризации и иннервации, что значительно влияет на скорость процессов репарации и, по-видимому, требует большего срока наблюдения, что в условиях эксперимента на крупных животных представляет серьёзную проблему.

Применяемая в процессе культивирования тканеиженерных хрящевых конструктов механическая стимуляция может являться фактором, увеличивающим синтетическую активность клеток в условиях in vitro и повышающим резистентность хрящевого регенерата к механическим нагрузкам после имплантации в сустав. Время создания подобного хрящевого трансплантата колеблется от 6 до 8 недель и зависит, в определённой степени, от возраста и породы лошади.

Спектр современных лечебных мероприятий по восстановлению суставного хряща лошади посредством тканевой инженерии может быть дополнен методом, разработанным в FZMB, который можно расценивать как фактор выбора при репарации хрящевых повреждений лошадей.

 

Материал предоставлен Конским ветеринарным объединением
Перевод с немецкого — Игорь Пономарёв

 

СВМ № 3/2014

Добавить комментарий

Войти с помощью: 
Close