Практическое применение гормона релаксина для определения беременности у собаки

Д. Боншариф, Д. Трентюрье, Х. Слама, Ж. Шемли, Н. Дарденне

Ранний диагноз на беременность у собаки может быть поставлен с помощью экспресс-теста ELISA, основанного на определении количественного содержания в крови гормона релаксина, выделяемого плацентой.

Несмотря на то, что раннее и достоверное установление беременности у собаки — процесс довольно обыденный, он не всегда протекает гладко. В основном для постановки диагноза на беременность прибегают к методам трансабдоминальной пальпации, эхографического и рентгенографического исследований.

Количественное определение прогестерона в крови не дает возможности отличить истинную беременность от ложной, так как оба эти процесса завершаются лактацией. Но вот уже четвертый год как клиницисты для установления беременности у собак используют метод определения количественного содержания релаксина в крови.

После рассмотрения возможностей разных методов диагностики беременности у собаки мы рассмотрим результаты практических исследований по определению количественного содержания гормона релаксина, секретируемого на протяжении беременности (постановка диагноза и количественное содержание релаксина в крови у собаки во время беременности).

Диагностика беременности у собаки

Трансабдоминальная пальпация
Трансабдоминальная пальпация — это традиционный и простой метод в техническом исполнении, качество которого часто определяется искусством клинициста. Установить беременность у собаки пальпаторно можно на 18–25 день. Однако этот метод применим далеко не всегда, особенно в отношении тучных или беспокойных животных.

Эхографическое исследование
С помощью ультразвукового зонда с частотой 5 МГц, применяемого при данном виде исследования, установить наличие беременности удается через 20 дней с момента вязки у собак малых размеров и несколько позже у собак крупных пород — на 21–23 день. Однако постановка диагноза на беременность у особей тучных или крупных пород вызывает большие сложности, и в связи с этим требуется повторное обследование неделей позже (на 28-й день).

Допплерографическое исследование
Метод допплерографии основан на определении потока крови, циркулирующей у плода или в плаценте с помощью ультразвукового аппарата. По данным Helper (1970) окончательная постановка диагноза может быть осуществлена через 32 дня с момента вязки.

Рентгенография
Этот метод диагностики беременности имеет большое значение, но осуществляют его на более поздних сроках, так это позволяет с высокой точностью определить количество щенков (подсчет по черепам) и получить информацию о наличии аномалий и риска дистоции.

Начиная с 42-го по 45-й день, после пика концентрации лютетропного гормона (LH), визуальное обнаружение оссификации плодов становится доступным (при условии выполнения рентгенологического клише хорошего качества).

Габитус (экстерьер) и типы поведения
При оценке габитуса в целом мы отмечаем:

— развитие молочных желез, начиная с 35-го дня;
— постепенное растяжение стенки живота, начиная с 5-й недели с момента наступления беременности;
— увеличение веса с варьирующейся интенсивностью в зависимости от особи и количества плодов.

Изменения в поведении: чаще всего сука спокойна, но при этом осторожна и довольно часто пытается уединиться.

Таким образом, беременность приводит к изменению физиологии и выраженной поведенческой реакции.

Эти изменения отмечаются на достаточно поздних сроках. Однако они могут быть выявлены значительно раньше, то есть до формирования скелета плодов (который обнаруживают, например, при рентгенографическом исследовании). Однако такой способ диагностики, как правило, основан на субъективных клинических признаках и, следовательно, менее точен, чем рентгенографическая картина. С другой стороны, все внешние признаки изменений необходимо оценивать в совокупности, потому что ни один из них в отдельности не является патогномоничным.

Эхографическое исследование, в сравнении с вышеописанными методами постановки диагноза на беременность, является наиболее достоверным на ранних сроках беременности пациента (иногда с 20-го дня), но данный метод требует навыка со стороны клинициста, а также необходимо учитывать высокую стоимость самого аппарата.

В 1987 году Steinetz и сотрудники сообщили о возможности выявления беременности у собаки, начиная с трехнедельного срока, методом количественного определения гормона релаксина, продуцируемого и выделяемого плацентой.

Релаксин (общие сведения)

Релаксин является единственным специфическим гормоном, который используют для постановки раннего и достоверного диагноза на беременность.

Структура
Релаксин — это гормон-полипептид с молекулярной массой равной 6,3 килодальтона, состоящий из двух субъединиц, связанных дисульфидными мостиками.

Синтез
Синтез и секреция релаксина во время беременности обеспечиваются, в основном, клетками плаценты на уровне трофобластов.

Возможно, что яичник также играет роль в синтезе и секреции релаксина в период беременности.

Кинетика
Гормон релаксин начинают определять в крови самки, начиная с 3-ей недели беременности, то есть с момента, когда происходит формирование плаценты, и он достигает пика 4–5 нг/мл за две или три недели до родов (его концентрация в течение суток не меняется, в отличие от прогестерона). После родов количество релаксина постепенно снижается и остается на уровне в пределах 0,5–2,0 нг/мл в течение 4–9 недель, после чего гормон полностью исчезает.

Релаксин обнаруживали у щенков после рождения до того, как они принимали молоко матери, затем к концу пятого часа он исчезал. Таким образом, можно предположить, что релаксин с кровью матери циркулирует в кровеносной системе плода во время беременности. Он также был обнаружен в молозиве, но его не выявляют в молоке сук с ложной беременностью. У самцов релаксин выделяли из семенной жидкости, но не из крови.

Роль
Впервые релаксин был выделен у свиноматок (порода Meishan) в 1927 году, и название он получил благодаря своей способности вызывать расслабление поперечнополосатой мышечной ткани в области таза, увеличивая тем самым просвет родовых путей. Его роль в период беременности была установлена значительно позже — в 1978 году, когда было доказано, что гормон вызывает расслабление гладкой мышечной ткани матки, обеспечивая таким образом, гармоничное увеличение размеров плода.

Применение релаксина в диагностике беременности и контроле ее течения

Принцип
Количественное определение релаксина в плазме крови осуществляют с помощью метода ELISA по типу «сэндвич» (ReproCHEK RELAXINE ELISA).

Поликлональные антитела по отношению к релаксину получают из крови иммунизированного релаксином кролика, которые фиксируют на стенке лунок плашки. Антитела улавливают релаксин, содержащийся в исследуемом образце. Реакцию антитело – антиген определяют путем добавления моноклональных, связанных с пероксидазой, антител к релаксину.

Затем, путем промывки, избавляются от нефиксированных к антигену (релаксину) антител, связанных с этим энзимом (ферментом); наличие пероксидазы определяют путем добавления субстрата, который разрушается под воздействием этого фермента и дает соответствующую окраску.

Чтение реакции можно осуществлять визуально или с помощью аппарата, предназначенного для измерения оптической плотности.

Метод
После забора образца крови в пробирку, содержащую гепарин, отделяют плазму путем центрифугирования в течение 10 минут со скоростью 3000 об./мин.

На плашке, предназначенной для микротитрации, располагается десять лунок, из них восемь используют для тестирования полученных образцов, а две — для проведения позитивного и негативного контролей. В каждую лунку, помещают 50 мкл растворителя (изготовление в условиях производства), затем добавляют 50 мкл субстрата.

Растворы по 100 мкл в объеме как без релаксина (негативный контроль), так и с его содержанием (позитивный контроль) помещают в две первые лунки.

В оставшиеся восемь лунок помещают 50 мкл сыворотки, предназначенной для тестирования. Плашку с лунками слегка потряхивают и затем оставляют на 10 минут при температуре 20°С.

Затем лунки опорожняют, просушивают абсорбирующей бумагой и четырехкратно промывают специальным раствором. 150 мкл раствора, содержащего моноклональные антитела к релаксину, промаркированные пероксидазой, помещают в каждую лунку, при этом слегка потряхивая плашку (фото 1).

Фото 1. Композиционный набор ReproCHEK RELAXINE ELISA
Фото 2. Пример количественного определения релаксина невооруженным глазом

Интерпретация полученных результатов
Оценку реакции осуществляют через пять минут при температуре 20°С.

Порогом чувствительности метода является негативный контроль (низкий показатель оптической плотности раствора, не содержащего релаксин, и отсутствие изменения цвета). Наличие релаксина в исследуемых образцах и в позитивном контроле (содержится известное количество релаксина), определяют по выявлению в лунках более интенсивной окраски раствора в сравнении с негативным контролем (фото 2). Метод считывания позволяет улучшить количественные показатели исследуемого материала путем измерения оптической плотности в диапазоне от 450 до 630 нм.

Величину пороговой оценки всегда определяют с помощью негативного контроля и учета некоторых нюансов: образец с оптической плотностью ниже или равный 0,2 рассматривают как материал, не содержащий релаксин. Если оптическая плотность негативного контроля превышает показатель 0,2, то пороговую оценку чувствительности (точку отсчета) определяют по результату анализа контроля (фото 3).

Фото 3. Оценка результатов с помощью определения оптической плотности

Опыт №1: диагностика беременности путем количественного определения релаксина
Двадцать три собаки разных пород в возрасте от года до шести лет во время течки для определения у них сроков овуляции и последующей вязки или искусственного осеменения были доставлены в «Центр Патологии Репродукции Национальной ветеринарной школы» в городе Нанте.

Животные были повязаны или искусственно осеменены свежей спермой двукратно (с интервалом 48 часов), когда эозинофильный индекс, определяемый во влагалищном мазке, и уровень прогестерона в крови превысили 90% и 8 нг/мл соответственно.

С 20-го по 42 день после повторной вязки или искусственного осеменения (в зависимости от возможностей владельцев) определяли количественное содержание релаксина в крови (забор последней осуществляли из яремной и дорсальной вены предплечья) и проводили трансабдоминальную эхографию с целью выявления беременности (табл.1).

Таблица 1. Определение беременности у 23-х собак. Сравнительная оценка методов определения количественного показателя релаксина и результатов эхографического исследования

Порода собаки Возраст Предполаг. срок берем-ти (сутки) Колич. определение релаксина (mg/ml) Определение релаксина на беременность Эхография Кол-во плодов
1 Афганская борзая / 20
22
0
0


/
2 Лабрадор 2 20
22
0
2,4

+

+
3 Бигль 4 21 0,96 + + 4F
4 Бигль 1 20
21
22
0
0
1,2


+


+
4F
2M
4F
5 Кортальский грифон 5 21
29
0,2
5,9
+
+

+
4F
2M
6 Бигль 4 21 1,4 + + 5F
5M
7 Бигль 2 21
22
28
0
0
0




/
8 Доберман 3 21
29
1,6
9,4
+
+

+
3F
3M
9 Вест-хайленд-уайт-терьер 3 21 0,9 + + 1F
3M
10 Кавалер-кинг-чарльз-спаниель 2,5 21
28
2,4
16
+
+
+
+
4M
11 Помесь ретривера 2 21
23
0,1
0,4
+
+

+
5F
12 Боксер 1 21
28
0
5,3

+

+
13 Метис ретривера 1 21 1,3 + N.T.
14 Метис ретривера 2 23 1,0 + + 9 щенков
15 Кинг-чарльз-спаниель 3,5 25 0,8 + + 2F
16 Ретривер 2 25 0 /
17 Бульдог 3 27 0 /
18 Бриарская овчарка 6 28 0 /
19 Ньюфаундленд 4 28
34
0
0


/
/
20 Бульдог 4 29 1,5 + + 2F
21 Бассет-хаунд 6 31 0,9 + +
22 Бульдог 3 42 1,3 + + 1F
5M
23 Кинг-чарльз-спаниель 1 42 7,6 + +
Примечания: NT – не тестировался , F – самка, М – самец

Опыт №2: определение количественного содержания релаксина в крови у собак во время беременности
У трех из двадцати трех собак, доставленных в «Центр Патологии Репродукции», ежесуточно (с 55-го дня беременности до родов и первые три дня после их завершения) проводили анализ крови (табл. 2).

Таблица 2. Количественное определение релаксина в процессе родов.

Порода Возраст (гг) День привода
и день первый
Роды
(1-й день)
Через сутки Через
двое суток
Через трое суток Кол-во щенков
1 Бигль 4 9,5 9,2 0,8 0,8 1,4 5M
5F
2 Метис ретривера 2 5,0 3,0 0,8 1,6 2,2 5F
3 Бигль 1 7,4 7,5 1,9 3,2 3,3 4F
2M
Средний арифметический показатель:
7,3 6,6 1,2 1,9 3,2
Примечания: F – самка, М – самец

Затем осуществляли забор по одному образцу крови до, во время и в течение первых трех дней с момента завершения родов.

Результаты исследования
Для интерпретации результатов, использовали позитивный контроль, полученный от стандартного набора (кита), дозированного на базе лаборатории биохимии Национальной ветеринарной школы (г. Нант) с содержанием релаксина в количестве равном 2,0 нг/мл. Что касается отрицательного контроля, то этот показатель был равен 0,0 мг/мл.

Оценку количественного содержания релаксина осуществляли путем измерения оптической плотности плазмы крови, полученной от каждой тестируемой собаки.

Опыт №1
После проведения количественного серологического исследования содержания релаксина в крови и трансабдоминальной эхографии было установлено, что шесть из двадцати трех собак оказались бесплодными, в то время как семнадцать были беременными.

У шести собак появление релаксина определяли с двадцать первого дня после повторной вязки, тогда как у собак под N2 и 4 наличие этого гормона приходилось ожидать на двадцать второй день (табл. 1). Что касается проведения трансабдоминальной эхографии у собак под N 5, 8 и 11, то результаты визуального исследования, проведенные на 21-ый день, оказались отрицательными, в то время как серологическая реакция по определению количества релаксина в крови, была положительной. Через неделю, после повторной консультации на 29-й день, с помощью эхографического исследования было установлено присутствие плодов.

Опыт №2: день родов
Во время родов содержание релаксина колебалось в пределах 6–7 нг/мл (табл. 2), тогда как падение его концентрации на первый день после родов составило до 1,2 нг/мл, и затем поднялось на третьи сутки до 3,2 нг/мл (рис.1).

Рисунок 1. Изменение релаксина в момент родов и последующие три дня (n=3)

Обсуждение
Опыт №1
Из 17 беременных сук у одной особи под N11 на 21-ый день концентрация релаксина в крови была равна 0,1 нг/мл. Она оказалась беременной, хотя эмбриональные пузырьки с помощью эхографа в этот срок беременности обнаружить не удалось.

Появление малого количества релаксина в крови является признаком беременности, который требует подтверждения неделей позже, путем проведения повторного количественного анализа плазмы крови, и эхографического исследования.

Релаксин обнаруживали на 21–22-й день после вязки. Вариации сроков появления данного гормона можно объяснить тем, что не было проведено уточнения даты начала беременности, путем количественного определения персистенции лютеотропного гормона.

У трех из девяти собак крупных пород №5, 8 и 11 эхографическую картину беременности выявляли позже, чем количественное появление релаксина в крови в трех случаях у кортальского грифона, добермана и помеси голден ретривера соответственно.

Опыт №2
Выброс щенков и фетальных оболочек в процессе родов сопровождается значительным снижением общего количества релаксина за довольно короткий промежуток времени, так как именно плацента является основным источником продуцирования этого гормона.

Было бы интересным отследить количественное содержание релаксина в организме матери на послеродовой период, чтобы узнать дату исчезновения и установить природу его образования (на низком уровне) в системе гемоциркуляции матери.

Заключение

Релаксин — это гормон беременности у сук, который появляется в системе гемоциркуляции с 21 по 22-й день после вязки и присутствует в больших количествах и в более поздние сроки, вплоть до начала родов.

Этот гормон представляет неоспоримый интерес для определения беременности на ее ранних сроках, особенно у особей крупных размеров, в отношении которых эхографическое исследование иногда может быть недостоверным и требовать повторного его проведения в более поздние сроки. Таким образом, в повседневной практике ветеринарные врачи могут установить беременность у сук путем определения концентрации релаксина в плазме крови с помощью быстрого теста ELISA (ReproCHEK RELAXINE ELISA), не прибегая в обязательном порядке к проведению эхографии.

СВМ 4/2005

Подпишитесь на наш телеграм-канал и получайте важные отраслевые новости в удобном для вас формате.
Оценить материал
Нравится
Нравится Поздравляю Сочувствую Возмутительно Смешно Задумался Нет слов
Теги

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Подписка на новости

* - поля, обязательные для заполнения
Нажимая на кнопку, вы даете согласие на обработку своих персональных данных согласно 152-ФЗ. Подробнее
Close