Применение цитологического исследования влагалищного мазка при воспроизводстве собак: обзор

А. L. Antonov,
Department of Obstetrics, Reproduction and Reproductive Disorders, Faculty of Veterinary Medicine, Trakia University, Stara Zagora, 6000, Bulgaria

Резюме

Практическое применение цитологии влагалищного мазка как в норме, так и при патологии весьма разнообразно. Цель обзора — описать применение цитологического исследования влагалищного мазка как диагностического метода в клинической репродуктологии собак.

Ключевые слова: сука, цитология влагалищного мазка

 

Введение

Цитологическое исследование влагалищного мазка — наиболее распространённый диагностический метод в рамках гинекологического обследования суки [13; 19; 32; 44; 45; 49; 24; 55; 52; 53; 18; 31; 56]. Он основан на определении циклических клеточных изменений, происходящих в эпителии влагалища в результате изменения уровня половых гормонов, в первую очередь — эстрогенов [57]. Метод прост и полезен даже при физиологических и патологических состояниях репродуктивной системы суки. Чаще всего он используется для определения стадий эстрального цикла для выбора оптимального времени вязки [53].

 

Процедуры для отбора клеток влагалища и получение мазков

Клетки влагалища для цитологического исследования могут быть собраны с использованием стерильного гинекологического зеркала и увлажнённого физиологическим раствором урогенитального зонда [58; 57; 20]. Важно не допустить контакт зонда с преддверием влагалища, потому что там клетки не так быстро реагируют на повышение уровня эстрогена в крови, как слизистая оболочка влагалища [40].

Клетки влагалища также можно собрать только зондом, без использования зеркала [17; 6; 27; 30; 3]. Ватный конец вводится во влагалище по его верхнему своду, при этом необходимо аккуратно надавливать в каудодорсальном направлении, пока зонд не пройдёт над седалищной дугой, после чего он проворачивается на полный оборот в каждом направлении и извлекается [3]. Затем ватный конец аккуратно прокатывается от одного конца предметного стекла до другого [17; 27; 30].

Клетки влагалища для цитологического исследования могут быть собраны с помощью введения в полость влагалища стерильного физиологического раствора и последующей его аспирации пластиковым катетером [36]. Жидкость наносится на предметное стекло, распределяется в виде тонкой плёнки и сушится на воздухе. Этот метод наименее инвазивен, однако иногда приводит к изменениям в морфологии клеток и снижению абсолютного числа клеток [34; 35; 21].

Мазки могут быть окрашены трихромом или красителем Папаниколау [38], но этот метод трудоёмок [16]. Многие авторы сообщали о его использовании с пропуском некоторых стадий окрашивания [4; 29; 14].

Мазки, окрашенные новым метиленовым синим (NMB), могут быть исследованы сразу после нанесения красителя, однако эритроциты при этом не окрашиваются, а мазки не сохраняются для последующего пересмотра [27]. Другие классические техники окрашивания используют такие красители, как Мэй-Грюнвальд, Берингер Маннхайм, Паппенхайм и Тестсимплетс^® [19].

Дифф-Квик^® или Гемаколор^® (Merck KGaA), модифицированные экспресс-варианты красителя Райта-Гимзы, просты для применения в клинической практике. Мазки фиксируются метанолом и затем окрашиваются красителем Дифф-Квик^® дважды. Эти мазки могут храниться долгие годы и исследоваться позднее [27; 7].

Aydin et al. [3] сравнивали прямой метод исследования влагалищных мазков с классическим окрашиванием с целью определения стадий полового цикла сук и выяснили, что метод надёжен только в определении стадии эструса.

 

Оценка влагалищного мазка

Влагалищный мазок исследуется с помощью световой микроскопии с увеличением от ×100 до ×400. Необходимо исследовать как минимум 10 полей зрения [51].

Существуют различные типы клеток влагалища [15]. Согласно большинству авторов, клетки стенки влагалища делятся на базальные, парабазальные, промежуточные, поверхностные и сквамозные [39; 41; 13; 21; 33; 51; 24].

В целом принято считать, что типы вагинальных клеток в мазке зависят от уровня эстрального цикла [5], что делает цитологическое исследование влагалищного мазка ценным дополнительным тестом в репродуктивной клинической диагностике [9; 15].

Базальные — мельчайшие клетки (10—20 мкм) стенки влагалища. Они практически полностью заняты ядром и редко наблюдаются во влагалищном мазке, поскольку расположены на базальной мембране [34; 57].

Парабазальные — маленькие (15—25 мкм) шарообразные или овоидные клетки с довольно большим ядром. Иногда они содержат цитоплазматические вакуоли. Парабазальные клетки могут также содержать в цитоплазме нейтрофильные гранулоциты, и тогда их называют метаэструсными клетками, хотя они могут появляться и на других стадиях цикла [57] или при вагините [35].

Промежуточные клетки значительно различаются в диаметре, поэтому разделяются на клетки двух типов, малые (20 мкм) и большие (30 мкм) [39; 13; 37; 33]. Оба типа содержат хорошо оформленное ядро. Малые промежуточные клетки имеют форму от круглой до эллиптической, но могут также быть полигональными, в то время как большие клетки отличает неправильной формы или угловатая цитоплазматическая граница [8]. Промежуточные клетки имеют заметные ядра. Большие промежуточные клетки иногда путают с поверхностными клетками, поскольку у них похожий размер [27].

Поверхностные клетки крупные, диаметром от 20 [8] до 75 мкм [10]. Они имеют неправильной формы или угловатые границы и тёмное, пикнотическое или бледное ядро. Поверхностные клетки достигают своего максимума во время эстрогенного пика [39; 8; 13; 10; 27; 33; 24].

Сквамозные клетки — это крупные ороговевшие клетки, которые перенесли дегенерацию и стали мёртвыми безъядерными клетками [43]. Обычно они окрашиваются тёмным сине-пурпурным цветом в период эструса [27].

Помимо клеток влагалища в мазках при цитологическом исследовании обнаруживаются и другие клетки: эритроциты, нейтрофилы (лейкоциты), бактерии, опухолевые клетки, эпителиальные клетки ямки клитора, сперматозоиды, гигантские трофобласты и посторонние включения [33].

 

Рис. 1. Влагалищный мазок суки в проэструсе: 1 — эритроцит; 2 — малая промежуточная клетка; 3 — большая промежуточная клетка; 4 — поверхностная клетка; 5 — сквамозная клетка (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)	Рис. 2. Влагалищный мазок суки в эструсе: 1 — поверхностная клетка; 2 — сквамозная клетка (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)

 

Клиническое применение цитологического исследования влагалищного мазка

Определение оптимального времени для вязки или искусственного осеменения

Фертильность у сук имеет большую социально-экономическую важность [31]. Большая часть сук, поступающих на приём с бесплодием в анамнезе, являются в действительности фертильными [11]. Самая частая (40—50%) причина неудачного зачатия в описанных случаях — неверно выбранное время вязки [59; 26].

Постепенный сдвиг от парабазальных и промежуточных клеток к поверхностным происходит во время проэструса. Кроме того, в это время присутствует большое число эритроцитов (рис. 1). Оптимальное время для естественной вязки или искусственного осеменения — стадия эструса, когда доля поверхностных и сквамозных клеток (рис. 2) в мазках из влагалища приближается к 80% [42; 27; 47]. Вязка или осеменение должны быть проведены в двух- или трёхдневный промежуток времени до наступления диэструса, что становится ясным по появлению парабазальных клеток, нейтрофилов [42; 47] и снижению количества поверхностных и сквамозных клеток как минимум до 20% [22] (рис. 3). Если вязка произошла в срок от 3 до 10 дней до наступления цитологического диэструса, вероятность зачатия с первой попытки превышает 95%. Определение первого дня цитологического диэструса позволяет понять, была ли вязка проведена в подходящее время [27].

Цитологическое исследование влагалищного мазка дополнительно применяется в случаях неявной течки («белой течки»), проявляющейся без кровяных влагалищных выделений при наличии поверхностных и сквамозных клеток во влагалищных мазках [57; 20].

 

Рис. 3. Влагалищный мазок суки на первый день диэструса: 1 — эритроциты; 2 — малые промежуточные клетки; 3 — большие промежуточные клетки; 4 — сквамозные клетки; 5 — нейтрофилы (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)	Рис. 4. Влагалищный мазок суки с вагинитом (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)

 

Прогнозирование даты щенения

Если вязка или осеменение произошли в оптимальное время для высокой вероятности зачатия, взятие серии мазков из влагалища и определение первого дня цитологического диэструса позволяют с большой точностью предсказать время щенения. Ожидаемый срок родов — 56—58 дней, наиболее часто (93% сук) — на 57-й день после наступления цитологического диэструса [22; 27].

 

Вагинит

Мазки из влагалища собак с вагинитом (рис. 4) обычно содержат полиморфно-ядерные лейкоциты и нередко бактерии [23].

 

Кисты и опухоли яичников

У сук с кистами или гранулёзоклеточными опухолями яичников отмечаются гормональные нарушения: сниженная продукция эстрогена, удлинённый эструс, набухание вульвы, дерматологические изменения и кистозная гиперплазия эндометрия с персистирующими серозно-кровянистыми выделениями. Влагалищная цитология характеризуется наличием более 80—90% поверхностных и сквамозных клеток, что сходно с нормальной фазой эструса, поэтому в этом случае рекомендуется ультразвуковое исследование брюшной полости [28; 50].

 

Остаточный яичниковый синдром

Остаточный яичниковый синдром определяется как присутствие функционирующей яичниковой ткани, оставшейся в брюшной полости при имевшей место овариогистерэктомии суки. Клинически проявляется наличием признаков проэструса и эструса, включая набухание вульвы и кровотечение, а также поведенческие изменения, такие как мечение [54]. В результате продукции эстрогена оставшейся тканью яичника при вагинальной эксфолиативной цитологии могут быть обнаружены ороговевшие эпителиальные клетки, сходные с наблюдаемыми при нормальном проэструсе и эструсе [48].

 

Нежелательная вязка

Цитологическое исследование влагалищного мазка — наилучший метод диагностики нежелательной вязки суки. Сперматозоиды могут обнаруживаться во влагалищных мазках спустя 24—36 часов после случки (рис. 5). Отсутствие спермы не исключает вязки [47]. Случается, что не удаётся обнаружить сперматозоиды, поскольку их действительно там нет в случае отсутствия вязки или же имела место копуляция без семяизвержения.

 

Опухоли влагалища

Трансмиссивная венерическая саркома является наиболее частой диагностируемой неоплазией у сук при цитологическом исследовании влагалищного мазка [47]. Влагалищные мазки (рис. 6) содержат огромное количество эритроцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, парабазальных, промежуточных клеток и клетки округлой и овоидной формы, содержащие внутрицитоплазменые вакуоли [2].

 

Субинволюция плацентарных участков

Субинволюция плацентарных участков (SIPS) появляется, когда инволюция матки затягивается, и у суки появляются кровянистые маточные выделения, которые вытекают из вульвы в течение нескольких недель после щенения [27]. Обычно фетальные трофобласты у сук находятся в верхней рыхлой соединительной ткани собственной пластинки в первые 2 недели после щенения [1]. У сук с SIPS эти трофобластные клетки не дегенерируют и продолжают внедряться в эндометрий и даже в миометрий, что приводит к повреждению кровеносных сосудов и нарушению нормального тромбообразования кровеносных сосудов эндометрия [25]. Эти многоядерные и сильно вакуолизированные трофобласты могут наблюдаться в вагинальных мазках при цитологическом исследовании у сук с SIPS [12] (рис. 7).

 

Рис. 5. Цитологическое исследование влагалищного мазка суки через час после вязки: 1 — сперматозоид; 2 — сквамозные клетки (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)	Рис. 6. Влагалищный мазок суки с трансмиссивной венерической саркомой. Er — эритроциты (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)
	Рис. 7. Трофобластная многоядерная клетка в мазке из влагалища суки с субинволюцией плацентарных участков (стрелка) (оригинальный снимок, Haemacolor®, ×100)

 

Заключение

Цитологическое исследование влагалищного мазка является очень полезным методом в клинической репродуктологии собак благодаря своей простоте, доступности оборудования и возможности получения быстрых результатов. Она может использоваться как ценное дополнение к любым другим репродуктивным исследованиям у сук. Несмотря на то, что этот метод является рутинным, до сих пор существуют некоторые нерешённые проблемы, например, связанные с влиянием копуляции и искусственного осеменения на динамику популяции клеток влагалища у собак.

 

Литература

1. Al–Bassam, M., R. Thomson & L. ODonnel, 1981. Normal postpartum involution of the uterus in the dog. Canadian Journal of Comparative Medicine, 45, 217–232.
2. Antonov, A., 2015. Successful treatment of canine transmissible venereal tumor using vincristine sulphate. Advances in Research, 5, 1–5.
3. Aydin, I., E. Sur, T. Ozaydin & D. Dinc, 2011. Determination of the stages of the sexual cycle of the bitch by direct examination. Journal of Animal and Veterinary Advances, 10, 1962–1967.
4. Barret, R., 1976. Exfoliative vaginal cytology of the dog using Wright's stain. Veterinary Medicine Small Animal Clinic, 71, 12361238.
5. Bell, E., J. Bailey & D. Christie, 1973. Studies on vaginal cytology during the canine oestrus cycle. Research in Veterinary Science, 14, 173–179.
6. Bowen, R., 2000. Techniques for preparing a canine vaginal smear. Fort Collins (USA). Colorado State University. http:/www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/ vc/prep.html (19 April 2016 date last accessed).
7. Chatdarong, K., N. Kampa, E. Axner & C. Linde Forsberg, 2002. Investigation of cervical patency and uterine appearance in domestic cats by fluoroscopy and scintigraphy. Reproduction in Domestic Animals, 37, 275–281.
8. Christie, D., J. Bailey & E. Bell, 1972. Classification of cell types in vaginal smears during the canine oestrus cycle. British Veterinary Journal, 128, 301–310.
9. Christie, D. & E. Bell, 1973. A guide to vaginal cytology in the oestrus cycle of the bitch. Veterinary Annual, 14, 212–215.
10. Concannon, P. & G. Digregorio, 1986. Canine vaginal cytology. In: Small Animal Reproduction and Infertility, A clinical Approach to Diagnosis and Treatment. ed T. Burke, Lea & Febiger, Philadelphia, pp. 96–111.
11. Concannon, P., J. McCann & M. Temple, 1989. Biology and endocrinology of ovulation, pregnancy and parturition in the dog. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement, 39, 3–25.
12. Dickie, M. & K. Arbeiter, 1993. Diagnosis and therapy of the subinvolution of placental sites in the bitch. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement, 47, 471–475.
13. Dreier, C., 1975. Vaginal cytology: Studies on the possibility of diagnosing normal and pathological cycles in the bitch. Wiener Tierarztliche Monatsschrift, 62, 188.
14. Dumon, C. & C. Morel, 1989. Use of the Diagnoestrus RAL kit for staining vaginal smears in bitces. Pratique Medicale et Chirurgicale de l'Animal de Compagnie, 24, 49–53.
15. Ehlers, J., 2000. Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Vaginalzytologie bei der Hundin und ihr Einsatz bei der Bestimmung des optimalen Belegungs– zeitraumers. Diss, Munchen.
16. England, G. & P. Concannon, 2002. Determination of the optimal breeding time in the bitch: basic considerations. In: Recent Advances in Small Animal Reproduction, eds P. Concannon, G. England & J. Verstegen, International Veterinary Information Service, Ithaca, New York, Usa.
17. Feldman, E. & R. Nelson, 1996. Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. 2nd edn, W.B. Saunders Company, Philadelphia, USA.
18. Groppetti, D., A. Pecile, C. Barbero & P. Martino, 2012. Vaginal bacterial flora and cytology in proestrus bitches: Role on fertility. Theriogenology, 77, 1549–1556.
19. Gunzel-Apel, A. & P. Koivisto, 1984. Aktuelles zum Sexualzyklus der Hundin- diagnostische Moglichkeiten durch vaginalzytilogische Untersuchungen mittels Testimplets. Der Praktische Tierarzt, 2, 161–172.
20. Gunzel-Apel, A., 1993. Fruchtbarkeitskontrolle bei der Hundin. Vet Reihe.
21. Guyant, L., 1988. Canine vaginal cytology. Veterinary Techniques, 9, 513–520.
22. Holst, P. & R. Phemister, 1974. Onset of diestrus in the beagle bitch: Definition and significance. American Journal of Veterinary Research, 35, 401–406.
23. Johnson, C., 1991. Diagnosis and treatment of chronic vaginitis in the bitch. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 21, 523–531.
24. Johnson, C., 2006. Fortpflanzungsstorungen. In: Labordiagnostik in der Kleintierpraxis, eds M. Willard & H. Tvedten, Urban & Fischer Verlag, Munchen, pp. 377–383.
25. Johnston, S., 1986. Subinvolution of placental sites. Current Veterinary Theriogenology, 9, 1231–1233.
26. Johnston, S., P. Olson & M. Root, 1994. Clinical approach to infertility in the bitch. Seminars in Veterinary Medical Surgery, 9, 2–6.
27. Johnston, S., M. Kustritz & P. Olson, 2001. Canine and Feline Theriogenology, 2nd edn, W. B. Saunders Company.
28. Koivisto, M., I. Carvalho, J. Carreira, J. Trevizan, G. Machado, F. Sueiro, L. Ciarlini & P. Gomes, 2012. Granulosa cell tumor in a bitch–case report. In: Proceedings of the 7th International Symposium on Canine and Feline Reproduction–ISCFR, Whistler, Canada.
29. Kubicek, J., 1978. A simplified vaginal smear method for hormonal cytodiagnosis in the bitch. Kleintierpraxis, 23, 259–262.
30. Kustritz, M., 2006. Collection of tissue and culture samples from the canine reproductive tract. Theriogenology, 66, 567574.
31. Leigh, O., L. Raji, & E . Diakodue, 2013. Detection of standing heat in bitches: Application of vaginal cytology. World Journal of Life Science and Medical Research, 3, 21–25.
32. Linde, C. & I. Karlson, 1984. The correlation between the cytology of the vaginal smear and the time of ovulation in the bitch. Journal of Small Animal Practice, 25, 7782.
33. Maneke, N., 2002. Untersuchung zur Beschreibung von Vaginalzellen der Hundin als ein Beitrag zur objektiven Zyklusdiagnostik. Veterinary Medicine Dissertation, Berlin.
34. Olson, P., M. Thrall & P. Wykes, 1984a. Vaginal cytology: Part I: A useful tool for staging the canine estrous cycle. Compendium of Continuous Education of the Practicing Veterinarian, 6, 288–298.
35. Olson, P., M. Thrall & P. Wykes, 1984b. Vaginal cytology. Part II. Diagnosing canine reproductive disorders. Compendium of Continuous Education of the Practicing Veterinarian, 6, 385–390.
36. Olson, P., T. Thomas, P. Husted & T. Nett, 1988. Clinical Evaluation of Infertility in the Bitch. Clinical Signs and Diagnosis in Small Animal Practice, ed R. B. Ford, Churchill Livingstone, New York, pp. 631–654.
37. Olson, P., 1989. Exfoliative cytology of the canine reproductive tract. In: Proceedings of the Annual Meeting of the Society for Theriogenology, Coeur d'Alene, ID, September 29–30. Nashville, Society for Theriogenology.
38. Papanicolaou, G., 1942. A new procedure for staining vaginal smear. Science of New York, 95, 438.
39. Rieck, G. & Kratzheller, K., 1955. Zytologie des desquamierenden Vaginalepithels der Hundin und ihre Anwendung fur die Zytodiagnostik. Zentralblatt der Veteri– narmedizin, 2, 82–101.
40. Rottger, K., 2010. Untersuchungen zur durchfuhrung der exfoliativen vaginalzytologie bei der hundin. Dissertation.
41. Schutte, A., 1967. Canine vaginal cytology — I. Technique and cytological morphology. Journal of Small Animal Practice, 8, 301306.
42. Simmons, J., 1970. The vaginal smear and its practical application. Veterinary Medicine/ Small Animal Clinician, 65, 369–373.
43. Simmons, J. & Olson, P., 1989. Nomenclature for small animal theriogenology. Society for theriogenology Newsletter, July/August.
44. Soderberg, S., 1986a. Canine breeding management. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 16, 419–433.
45. Soderberg, S., 1986b. Vaginal disorders. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 16, 543–559.
46. Stone, E., C. Cantrell & N. Sharp, 2003. Ovary and uterus. In: Textbook of Small Animal Surgery, 2nd edn, ed D. Slatter, W. B. Saunders Company, Philadelphia, USA, pp. 1293–1308.
47. Srinivas, M., N. Lakshmi Rani, K. Suresh & M. Sreenu, 2004. Vaginal exfoliative cytology as a tool in diagnosing reproductive disorders in bitches. Intas Polivet, 5, 354–356.
48. Stone, E., 2003. Textbook of Small Animal Surgery, 3rd edn, W. B. Saunders, Philadelphia, p. 1498.
49. Tammer, I., K. Blendinger, A. Sobiraj & H. Bostedt, 1994. Uber den Einsatz der exfoliativen Vaginalzytologie im Rahmen der gynakologischen Befunderhebung bei der Hundin. Tierarztliche Praxis, 22, 199207.
50. Tavasoli, A. & A. Solati, 2011. Granulosa cell tumor of the ovary in dog: Case Report from Teheran. Journal of Cell and Animal Biology, 5, 66–68.
51. Theise, B., 2002. Unterstutzung zur Entwicklung eines computergestutzten Lernprogramms zu den Grundlagen der Gynakologie bei der Hundin. Dissertation.
52. Trasch, K, 2008. Gynakologie bei der Hundin. CVE Kleintier, 2, 9–14.
53. Turmalay, L., S. Duro, E. Lika & V. Ceroni, 2011. The hormonal control of estrus in bitches. Journal of Animal and Veterinary Advances, 10, 2447–2449.
54. Wallace, M., 1991. The ovarian remnant syndrome in the bitch and queen. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 21, 501–507.
55. Wehrend, A., 2007. Durchfuchrung und Interpretation der exfoliativen Vaginal– zytologie bei der Hundin. Spektrum Tiermedizin 9, Veterinarsspiegel Verlag, Berlin.
56. Wehrend, A., K. Von Plato & S. Goericke-Pesch, 2013. Die exfoliative vaginal–zytologie bei der hundin–indikationen, durchfuhrung, interpretation. Tierarztliche Praxis, 4, 267–274.
57. Wright, P. & B. Parry, 1989. Cytology of the canine reproductive system. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 19, 851–874.
58. Wrobel, K., M. El–Etreb & P. Gunzel, 1975. Histochemical and histological studies of the vagina of the beagle during various functional conditions. Acta Histochemica, 52, 257–270.
59. Zoldag, L., Kecskemethy, S. & P. Nagy, 1993. Heat progesterone profiles of bitches with ovulation failure. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement, 47, 561–562.

 

 

Источник: Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 2017, 20, No 3, 193–203. The BJVM operates under Creative Commons License BY-NC-ND 4.0.

 

СВМ № 6/2017

 

Подпишитесь на наш телеграм-канал и получайте важные отраслевые новости в удобном для вас формате.