Сравнение окрашивания нервов пищевым красителем, метиленовым синим или тканевым маркером

Введение

Местная анестезия широко используется в ветеринарной хирургии и других специальностях для обеспечения надёжной основной или адьювантной анальгезии [16]. Исследования на кадаверном материале проводятся для разработки новых регионарных методов; они включают инъекцию красителя с последующим рассечением и визуализацией окрашивания нерва для подтверждения успешного воздействия на интересующий нерв. Несмотря на важность окрашивания нервов, определение того, окрашен нерв или нет, в настоящее время полностью основано на субъективной оценке исследователей. Однако красители для нервов и их разбавители (обычно местные анестетики) могут демонстрировать несоответствие качества окрашивания нервов [7; 28; 14]. Это может затруднить оценку того, было ли успешно воздействие на интересующий нерв, и привести к расхождениям в исследованиях.

Внутри каждого нерва пучки аксонов окружены периневрием, который, в свою очередь, инкапсулирован самым внешним слоем, эпиневрием [23]. Единственным существующим критерием того, считается ли нерв успешно окрашенным, является наличие красителя по окружности эпиневрия на протяжении как минимум 1 см длины нерва [22]. Однако возможно, что некоторые красители не проникают в эпиневрий, что делает их случайное удаление (т. е. агрессивное удаление эпиневрия во время диссекции) потенциальным источником ошибки интерпретации результатов. Таким образом, ещё одним часто упускаемым из виду, но потенциально важным фактором при выборе подходящего красителя для нервов является способность или отсутствие таковой окрашивать нервную ткань, лежащую под эпиневрием.

Наиболее часто используемые красители для окрашивания нервов включают коммерческий пищевой краситель (FD), разбавленный 0,5% бупивакаином [13], 1% метиленовым синим (MB) [9; 10], и жёлтый тканевой маркер (ТМ), разведённый 2% лидокаином [12; 20; 26; 4], но исследований, в которых сравнивалось бы качество окрашивания этих маркеров, не проводилось. Целью этого исследования было объективное количественное определение и сравнение качества окрашивания (т. е. насыщенности цвета, площади окрашенной поверхности нерва и глубины впитывания красителя) обычно используемых красителей и их разбавителей. Было высказано предположение, что FD в бупивакаине приведёт к наибольшей насыщенности цвета и площади окрашивания как в поверхностных (т. е. неповреждённом эпиневрии), так и в глубоких (т. е. субэпиневральных, после продольного рассечения пополам) слоях нерва.

Ключевые слова: пищевой краситель, местная анестезия, краситель метиленовый синий, окрашивание нервов, тканевой маркер.

Материалы и методы

Животные

Шесть только что эвтаназированных самок йоркширских свиней весом 58 ± 1,3 кг (среднее значение ± стандартное отклонение) и возрастом 4 месяца были получены в результате не связанного с данным терминального исследования. Препарирование и окрашивание нервов проводили в помещении с контролируемой температурой (21 °C), влажностью (30%) и флуоресцентным освещением. Первоначально трупы помещали в положение лёжа на боку, стороной, подлежащей рассечению, вверх. При отведённой грудной конечности производили разрез кожи в подмышечной области, пересекая кожную мышцу туловища, а также поверхностную и глубокую грудные мышцы. Тупую диссекцию тканей проводили до тех пор, пока не было идентифицировано плечевое сплетение. Подмышечные артерия и вена были идентифицированы, изолированы и пережаты, чтобы предотвратить загрязнение кровью. Лучевой, подмышечный и срединный нервы идентифицировали и иссекали. Изолированные нервы толщиной 0,5–1 см разрезали скальпелем на сегменты длиной 2–5 см, длину которых подтверждали с помощью линейки. Нервы меньшего размера или сильно окрашенные кровью были исключены из исследования. Аналогичные шаги были выполнены для сбора контрлатеральных нервов. Всего было собрано 6 нервов от каждого животного. Все образцы были получены в течение 1 часа после эвтаназии, а нервы были собраны, окрашены и сфотографированы в течение 4 часов после эвтаназии.

Исследование проводилось в течение 6 дней с одной эвтаназией свиней в день. Перед эвтаназией этим животным не проводилось никаких процедур на грудных конечностях. Для этого исследования не требовалось одобрение институтского этического комитета.

Группы красителей нервов и изображения

Тридцать шесть изолированных нервных сегментов рандомизированно блокировали с использованием карточек, выбранных из конверта, в одну из трёх групп (n 1/4 12 в каждой): группа FD, смесь FD (Blue Food Color; McCormick Culinary, MD, 1:10, США) и бупивакаин («Сенсоркаин-МПФ», 0,5%; Fresenius Kabi, IL, США); группа MB — метиленовый синий (Mettelen Blue, 1%; Consolidated Chemicals & Solvents LLC, Пенсильвания, США); и группа TM, смесь 0,1:10 синего TM (The Davidson Marking System, Blue Marker; Bradley Products, Inc, Миннесота, США) и лидокаина (лидокаин, 2%; MWI Animal Health, ID, США). Эти соотношения FD [14], MB [9; 10] и TM [12; 20; 26; 4] идентичны описанным в литературе. Три нерва в каждой группе из 12 нервов были рандомизированы для погружения в соответствующие красители на один из четырёх периодов времени: 1, 15, 30 и 60 минут. Был использован синий, а не жёлтый TM, поскольку он имеет тот же оттенок, что и наиболее часто встречающийся нервный краситель MB. Кроме того, избегали использования нервных красителей жёлтого оттенка, поскольку они могли имитировать естественную неокрашенную нервную ткань, что усложняло способность программы анализа изображений различать окрашенную и неокрашенную нервную ткань.

Сцена для фотосъёмки была построена с использованием чёрного прямоугольного стола с двумя фотолампами (Fovitec Studio Pro — 4500K; Fovitec USA, Ирвайн, Калифорния, США). Положение всего фотооборудования было отмечено на полу скотчем для обеспечения стандартизации. Изображения были получены с помощью цифровой камеры (цифровая камера Sony a7R III; Sony, Токио, Япония) с зум-объективом (Sony FE Zoom 2.8/24–70 GM; Sony, Токио, Япония) с одинаковыми настройками и условиями освещения на протяжении всего периода съёмки.

Все сегменты нервов помещали на чистую белую бумагу формата А4 для визуализации рядом с чёрной линейкой из нержавеющей стали длиной 15 см (Vowcarol Machinist Ruler; Esprite, Guangdong, CN), используемой в качестве шкалы. Базовые изображения всех сегментов нервов были получены до погружения в краситель.

Красители разливали в стерильные пластиковые контейнеры ёмкостью 100 мл (контейнер для образцов мочи AMSure; Amsino International, Калифорния, США) и меняли в начале каждого дня. Сегменты нервов окрашивали, помещая нерассасывающуюся шовную нить из чёрной нейлоновой мононити (Ethicon 3–0 Ethilon; Деласко, Айова, США) на один конец и подвешивая нерв в красителе. Время погружения фиксировали с помощью стандартного кухонного таймера (кухонный таймер и секундомер KT3; Lavatools, Калифорния, США). После обработки избыток красителя удаляли, помещая сегменты нервов на короткое время на чистую марлю, а затем сегменты переносили на лист чистой белой бумаги для фотографии после погружения. Затем каждый нервный сегмент разрезали пополам в продольном направлении с использованием нового лезвия скальпеля №10 (хирургические лезвия из углеродистой стали Integra Miltex; Kai Medical, Техас, США). Было получено изображение раздвоенного нерва и проанализирована одна из его половин.

Анализ изображений

Анализ цветных исходных и окрашенных изображений нервов проводился с использованием программного обеспечения ImageJ (ImageJ; Национальный институт здравоохранения, США). Изображение нерва, расположенное рядом с линейкой, загружалось в программу и, совмещая прямолинейный инструмент программы с линейкой, устанавливалось масштабирование количества пикселей на сантиметр. Чтобы вычислить общую площадь нерва, изображение было настроено на цветовой порог, при котором можно было изменить три переменные: спектр оттенка, насыщенность и яркость. Программное обеспечение присвоило каждой переменной числовое значение в диапазоне от 0 до 255 (безразмерная шкала). Спектр оттенков и насыщенность не были изменены (0–255), тем самым включая все цвета нерва. Яркость была отрегулирована таким образом, чтобы выделить нерв и отбросить весь фоновый цвет. После того как была выбрана вся площадь нерва, изображение было обработано и преобразовано в бинарное изображение (чёрный — область интереса (нерв); и белый — фон) для ручного удаления посторонних пикселей, которые были пропущены во время первого процесса выбора. На этом этапе с изображения убиралась и линейка. Изображение анализировали и измеряли площадь чёрного цвета в см2. Подобные шаги были повторены для расчёта площади, занимаемой каждой насыщенностью цвета; однако оттенок был скорректирован так, чтобы включать только зелёно-сине-пурпурный цветовой спектр (цвета нервных красителей, 70–210 по шкале оттенков) и исключить жёлто-оранжевые цвета (0–69 и 211–255), которые могли быть вторичными по отношению к остаточной крови или неокрашенным частям нерва и потенциально способствуют ложным результатам. Яркость была отрегулирована таким образом, чтобы вычесть фон из поддающейся количественной оценке области изображения, тем самым сделав весь поддающийся количественному измерению белый цвет дифференцированным как неокрашенный нерв, а не фон. В диапазоне зелёно-сине-фиолетовых оттенков заданные (сгенерированные программным обеспечением) значения насыщенности были разделены на квартили: тёмная насыщенность (191–255), средне-тёмная насыщенность (127–190), средне-светлая насыщенность (63–126) и светлая насыщенность (0–62). Область, занимаемая каждым диапазоном насыщенности, была выделена, преобразована в двоичный формат (чёрный и белый), и измерены чёрные области. Сумма всех площадей в пределах этого диапазона оттенков была вычтена из общей площади нерва, рассчитанной ранее, чтобы получить неокрашенную площадь нерва.

Статистический анализ

Анализ данных проводился с использованием коммерческого программного обеспечения (JMP Pro15; SAS Institute Inc., Северная Каролина, США). Нормальность данных оценивали с использованием теста Шапиро–Уилка на 36 изолированных иссечённых нервах. Двусторонний дисперсионный анализ использовался для моделирования присутствия красителя в зависимости от времени, группы и их состава и взаимодействия. Затем использовали апостериорный тест Тьюки для изучения не только различий между группами лечения в определённые моменты времени, но также различий внутри каждой группы лечения с течением времени; и скорректировали значения p среди множественных сравнений. Площадь нерва, окрашенную каждым красителем в каждый момент времени, выражали в процентах от общей площади нерва. Различия считали значимыми при значении р < 0,05.

Илл. 1. Изображения нервов до погружения (базовый уровень). Эти изображения были загружены в программное обеспечение ImageJ для оценки эпиневрального (поверхностного) окрашивания. FD: пищевой краситель 1:10 + 0,5% бупивакаин, МB: 1% метиленовый синий, ТМ: тканевой маркер 0,1:10 + 2% лидокаин

Илл. 2. Средняя площадь нервов (%), окрашенных поверхностно (т. е. эпиневральное окрашивание) для каждого квартиля насыщенности: (a) тёмный, (b) средне-тёмный, (c) средне-светлый и (d) светлый после погружения в один из 3 нервных красителей на 1, 15, 30 и 60 минут. (е) Средняя площадь нерва (%) без окрашивания. FD: пищевой краситель 1:10 + 0,5% бупивакаин, МB: 1% метиленовый синий, ТМ: тканевой маркер 0,1:10 + 2% лидокаин. Столбики ошибок представляют собой стандартную ошибку средней площади. Отсутствие столбцов ошибок указывает на значения стандартных ошибок, близкие к среднему значению (< 0,5%)

Полученные результаты

Поверхностное окрашивание

Перед погружением ни один из нервов не имел поверхностного (эпиневрального) окрашивания в зелёно-сине-пурпурный оттенок. На илл. 1 представлены фотографии целых нервов до обработки красителями в каждый момент времени.

Различия между группами красителей в любой момент времени поверхностного окрашивания представлены в Приложении SA. Эти таблицы содержат статистически и не статистически значимые значения p между значимыми группами (с течением времени внутри каждой группы красителей и между группами красителей в одинаковые моменты времени). Среднее значение (стандартная ошибка) процента площади, занимаемой каждым квартилем насыщения смесей красителей с течением времени для поверхностного окрашивания, показано на илл. 2. На илл. 3 показаны фотографии целых нервов после обработки красителями в каждый момент времени.

Илл. 3. Изображения нервов, полученные после погружения в 1 из 3 красителей на 1, 15, 30 или 60 минут. Эти изображения были загружены в программное обеспечение ImageJ для оценки эпиневрального (поверхностного) окрашивания. FD: пищевой краситель 1:10 + 0,5% бупивакаин, МВ: 1% метиленовый синий, ТМ: тканевой маркер 0,1:10 + 2% лидокаин

Глубокое окрашивание (продольный разрез пополам)

Различия между группами красителей в любой момент времени при глубоком окрашивании представлены в Приложении SB. Эти таблицы содержат статистически и не статистически значимые значения p между значимыми группами (с течением времени внутри каждой группы красителей и между группами красителей в одинаковые моменты времени). Среднее значение (стандартная ошибка) процента площади, занимаемой каждым квартилем насыщения смесей красителей с течением времени для глубокого окрашивания, показано на илл. 4.

На илл. 5 представлены фотографии продольно разделённых пополам нервов после обработки красителями на каждый момент времени.

Апостериорный анализ размера выборки проводился с использованием процента площади, занятой значениями насыщения, которые были гранично значимыми, с использованием G*Power версии 3.1 (Университет Генриха Гейне в Дюссельдорфе). Анализ размера выборки показал, что исследование с участием в общей сложности 8 нервов для каждой комбинации красителя и временной точки обнаружило статистически значимую разницу между группами, использующими альфа 0,05 и 80% мощности. Для текущего размера выборки из 3 нервов на группу и альфа 0,05 существует 80%-я вероятность обнаружения эффекта d 1/4 3,07.

Илл. 4. Средняя площадь продольно разделённого пополам нерва (%) для каждого квартиля насыщенности: (а) тёмный, (b) средне-тёмный, (c) средне-светлый и (d) светлый после погружения в один из 3 нервных красителей на 1, 15, 30 и 60 минут. (e) Средняя площадь нерва (%) без окрашивания. FD: пищевой краситель 1:10 + 0,5% бупивакаин, МВ: 1% метиленовый синий, ТМ: тканевой маркер 0,1:10 + 2% лидокаин. Столбики ошибок представляют собой стандартную ошибку средней площади. Отсутствие столбцов ошибок указывает на значения стандартных ошибок, близкие к среднему значению (< 0,5%)

Илл. 5. Изображения продольно разделённых пополам нервов после погружения в один из 3 красителей на 1, 15, 30 или 60 минут. Эти изображения были загружены в ImageJ для оценки субэпиневрального (глубокого) окрашивания. FD: пищевой краситель 1:10 + 0,5% бупивакаин, МВ: 1% метиленовый синий, ТМ: тканевой маркер 0,1:10 + 2% лидокаин

Глубокое окрашивание (продольный разрез пополам)

Различия между группами красителей в любой момент времени при глубоком окрашивании представлены в Приложении SB. Эти таблицы содержат статистически и не статистически значимые значения p между значимыми группами (с течением времени внутри каждой группы красителей и между группами красителей в одинаковые моменты времени). Среднее значение (стандартная ошибка) процента площади, занимаемой каждым квартилем насыщения смесей красителей с течением времени для глубокого окрашивания, показано на илл. 4. На илл. 5 представлены фотографии продольно разделённых пополам нервов после обработки красителями на каждый момент времени.

Апостериорный анализ размера выборки проводился с использованием процента площади, занятой значениями насыщения, которые были гранично значимыми, с использованием G*Power версии 3.1 (Университет Генриха Гейне в Дюссельдорфе). Анализ размера выборки показал, что исследование с участием в общей сложности 8 нервов для каждой комбинации красителя и временной точки обнаружило статистически значимую разницу между группами, использующими альфа 0,05 и 80% мощности. Для текущего размера выборки из 3 нервов на группу и альфа 0,05 существует 80%-я вероятность обнаружения эффекта d 1/4 3,07.

Обсуждение

В биомедицинской литературе пищевой краситель успешно используется для окрашивания нервной ткани, паразитов и бактерий [25; 27; 24], обеспечивая безопасную, широкодоступную альтернативу другим красителям. Результаты настоящего исследования подтверждают гипотезу о том, что использование FD обеспечивает более быстрое поверхностное (эпиневральное) насыщение тёмного цвета по сравнению с MB и TM. Более того, глубокие (субэпиневральные) тёмные и средне-тёмные насыщенности цвета были обнаружены только при FD. Таким образом, использование FD может помочь исследователям легче идентифицировать окрашивание нервов при исследованиях на трупах.

Метиленовый синий — слабогидрофильный катионный диаминотиазин, широко используемый для изготовления красителей Романовского [31] и для окрашивания бактерий и других инфекционных агентов [5; 2; 3; 21]. MB также рекомендован в качестве прижизненного красителя для нервов центральной нервной системы, и поэтому использовался для окрашивания нервов у живых пациентов в медицине человека [17]. Однако в недавних статьях в ветеринарной литературе сообщалось об использовании этого красителя для трупных исследований методов местной анестезии со смешанными результатами с точки зрения распределения и качества окрашивания [7; 14]. Возможно, что качество раствора MB и его смесей различаeтся в экспериментах in vivo и ex vivo и что его способность насыщения цвета изменяется под воздействием этих переменных условий. В настоящем исследовании MB и FD имели сравнимую насыщенность поверхностного тёмного и средне-тёмного цвета после 15 минут воздействия красителя; однако меньшая область насыщенности средне-светлых и светлых цветов была обнаружена внутринейронно в MB. Поверхностно нанесённый MB не проникает в кожу и костные ткани на глубину более 0,5 мм [13; 11], что может объяснить отсутствие насыщенности тёмных и средне-тёмных цветов субэпиневрально при использовании MB. Это может быть недостатком, если во время диссекции эпиневрий будет случайно удалён, что может привести к ложноотрицательному результату окрашивания нерва. Более высокая часть неокрашенной области в рассечённом нерве для MB на 30-й минуте является неожиданной. Одним из потенциальных ограничений, которое может объяснить это расхождение в данных, является природа насыщенного тёмного периневрального окрашивания MB. В случае раздвоенных нервов программное обеспечение ImageJ может обнаружить синее внешнее окрашивание в центре раздвоенного нерва, если конкретный образец нерва тонкий. При FD краситель присутствует в виде градиента и не имеет такого резкого контраста между неокрашенным и тёмным, насыщенным пятном под ним. Для изучения этой возможности необходимы будущие исследования.

Красители для маркировки тканей используются для ориентации вырезанных хирургических образцов, поскольку они обладают необходимыми качествами быстрого высыхания, непрозрачной пигментации и могут использоваться как на свежих, так и на фиксированных формалином образцах. Совсем недавно в ветеринарной медицине они стали использоваться как часть техники окрашивания при исследованиях на трупах [12; 20; 8; 26; 4]. В использованной здесь концентрации ТМ вызывал окрашивание нижележащих нервов независимо от продолжительности погружения (до 60 минут). Это контрастирует с предыдущими отчётами [12; 20; 26; 4]; однако эти исследователи использовали жёлтый ТМ для окрашивания трупных нервов, который мог бы иметь лучшую окрашивающую способность, чем синий ТМ, используемый в настоящем исследовании. Жёлтый ТМ не рекомендован к использованию, поскольку он имеет оттенок неокрашенных нервов и может затруднить дифференциацию в программе анализа цветных изображений. Также возможно, что более высокая концентрация, другой цвет ТМ или другой разбавитель приведут к лучшей насыщенности цвета.

Метиленовый синий токсичен, канцерогенен, не поддаётся биологическому разложению и представляет серьёзную угрозу для здоровья человека и благополучия окружающей среды (Национальная токсикологическая программа, 2008). Красящая добавка FD&C Blue №1 является основным компонентом коммерческого FD, используемого в этом исследовании, который одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для потребления с 1969 года (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США, 2022).

Коммерческий FD ранее использовался в качестве нетоксичной альтернативы окрашиванию на живых животных [25]. ТМ не содержит опасных ингредиентов в количествах, требующих раскрытия согласно Стандарту информирования об опасностях OSHA (Система маркировки Дэвидсона, 2012). По этим причинам FD и ТМ предпочтительнее МВ. Есть несколько ограничений данного исследования. Поскольку нервы были получены из свежих трупов свиней, несмотря на их гистологическое сходство, возможно, что красители ведут себя по-разному в консервированных формалином трупах или трупах, принадлежащих другим видам. Нервы в этом исследовании были погружены в краситель in vitro на определённый период времени; поэтому мы не можем предсказать поведение красителя in situ в трупе или in vivo.

Красители и разбавители, использованные в настоящем исследовании, были выбраны из наиболее часто публикуемых в литературе комбинаций; однако влияние различных разбавителей (лидокаин для ТМ, бупивакаин для FD и физиологический раствор для МB) на способность красителей насыщать нервы неизвестно.

Необходимы дальнейшие перекрёстные эксперименты, чтобы выяснить, влияют ли разбавители на наблюдаемые различия между FD и TM.

Настоящее исследование не включало расчёт размера выборки; однако был проведён апостериорный анализ мощности. Использование 3 нервов на группу позволило получить статистически значимые результаты относительно времени начала и поверхностной насыщенности цвета между обработками красителем. Апостериорный анализ мощности выборки сравнений, значения p которых были близки к значимости, определил, что большее количество нервов на группу потребовалось бы для статистической проверки тенденций, наблюдаемых в этих группах. Потенциальным ограничением статистической методологии является рассмотрение всех нервных сегментов как независимых; хотя подобные прецеденты имеются в литературе, это не было подтверждено сравнением с анализом эффектов смешанной модели в данном исследовании [32; 33].

Было обнаружено, что только FD диффундирует в более глубокие слои нерва. С одной стороны, краситель, который проникает в ткань-мишень, обеспечивает обнаружение окрашивания независимо от того, был ли эпиневрий случайно удалён во время диссекции. С другой стороны, может быть трудно отличить пассивную абсорбцию FD в нерв от непреднамеренной внутринейральной инъекции красителя. Хотя это и не исследовалось здесь, вполне разумна гипотеза о том, что характер интраневрального окрашивания нервов будет разным при интра- и экстраневральном отложении красителя; должен быть заметен градиент насыщенности от поверхностного к глубокому для последнего и наоборот — для первого. Принимая во внимание опубликованные данные о том, что внутринейральные инъекции обычно приводят к высокой резистентности к инъекции растворов (метод, используемый в клинической практике для идентификации интраневральной инъекции), вполне вероятно, что интраневральные инъекции будут обнаруживаться, даже если внутри нерва происходит пассивная абсорбция [30]. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения различий между внутри- и экстраневральным окрашиванием.

Текущее исследование показало, что FD обладает свойствами быстрой диффузии через нервные ткани; однако его способность диффундировать через другие ткани неизвестна и здесь не оценивалась. Поэтому возможно, что инъекция FD в ткани, отличные от места расположения целевого нерва, особенно если она связана с более длительным временем диссекции, может привести к неправильной идентификации (ложноположительный результат) успешного периневрального отложения инъекционного препарата. Крайне важно, чтобы при разработке методологии регионарной анестезии исследователи знали объективные характеристики окрашивания доступных красителей и выбирали краситель, наиболее подходящий для исследования.

Наконец, в этом исследовании изучалась только связь между площадью, занимаемой различными насыщенностями, временем воздействия и типом красителя. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить значимость между этими переменными и субъективной оценкой окрашивания нервов клиницистами.

Выводы

Основываясь на различном поведении красителей, о которых сообщается здесь, исследователи могут выбирать, а не исключительно отдавать предпочтение одному в использовании красителей для исследований на трупах. FD окрашивает нервную ткань с более быстрым временем начала и более глубоким проникновением в ткань, чем MB или TM. Оптимальный выбор красителя может варьироваться в зависимости от прогнозируемого времени рассечения, сложности или типов задействованных тканей. В конечном итоге исследователи могут использовать характеристики окрашивания этих красителей и ImageJ, количественный метод оценки качества окрашивания, чтобы повысить объективность исследований трупных красителей для разработки локорегиональных методов. Необходимы дальнейшие исследования для изучения поведения этих растворов красителей в других распространённых сценариях исследований, таких как различные комбинации разбавителей, модели трупного материала или живых тканей.

Литература

1. Bancroft J, Gamble M (2002) Theory and Practice of Histological Techniques (5th edn). Churchill-Livingstone, UK. pp. 344e358.
2. Barrow GI, Feltham RKA (1993) Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria (3rd edn). Cambridge University Press, UK.Р. 352.
3. Carson FL (1997) Histotechnology: A Self-Instructional Text (2ndedn). American Society for Clinical Pathology Press, USA. Р. 160.
4. Cavalcanti M, Teixeira JG, Medina-Serra R et al., (2022) Erector spinae plane block at the thoracolumbar spine: a canine cadaveric study. Vet Anaesth Analg 49, 656e663.
5. Clark G (1981) Staining Procedures (4th edn). Williams and Wilkins, USA. Рp. 413–414.
6. Davidson Marking System Blue Dye (2012) All Sizes; SDS No. 00105 [Online]; Davidson Marking System: Bloomington, MN. http://www.newcomersupply.com/documents/sds/6906% 20thru%2069088%20Davidson%20Tissue%20Dyes%20Blue% 20all%20sizes.pdf. (Accessed 2 April 2022). Last accessed.
7. de Miguel Garcia C, Whyte M, St James M, Ferreira TH (2020) Effect of contrast and local anesthetic on dye spread following transversus abdominis plane injection in dog cadavers. Vet Anaesth Analg 47, 391–395.
8. Delgado OBD, Louro LF, Rocchigiani G et al., (2021) Ultrasound- guided erector spinae plane block in horses: a cadaver study. Vet Anaesth Analg 48, 577–584.
9. Droz_dz_ynska M, Monticello P, Neilson D, Viscasillas J (2017) Ultrasound-guided subcostal oblique transversus abdominis plane block in canine cadavers. Vet Anaesth Analg 44, 183–186.
10. Ferreira TH, Teixeira LBC, Schroeder CA et al., (2018) Description of an ultrasound-guided thoracic paravertebral block technique and the spread of due in dog cadavers. Vet Anaesth Analg 45, 811–819.
11. Gailey DG, Krishnan DG, Marciani RD (2014) Depth of penetration of methylene blue in mandibular cortical bone. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol 117, 246–248.
12. Garbin M, Diego AP, Bertolizio G et al., (2020) A novel ultrasound-guided lateral quadratus lumborum block in dogs: a comparative cadaveric study of two approaches. Vet Anaesth Analg 47, 810–818.
13. Genina EA, Bashkatov AN, Tuchin VV (2002) In vitro study of methylene blue diffusion through the skin tissue. Proc SPIE 4609, 29–36.
14. Hon S, de Miguel Garcia C, Parry S (2023) Ultrasound guided maxillary block in pigs: a feasibility dye study. Vet Anaesth Analg 50, 107, 110–111.
15. Kiernan JA (1999) Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice (3rd edn). Butterworth-Heinemann, UK. Рp. 31–114.
16. Lemke KA, Dawson SD (2000) Local and regional anesthesia. Vet Clin North Am Small Anim Pract 30, 839–857.
17. Moorthy SS, Dierdorf SF, Yaw PB (1992) Influence of volume on the spread of local anesthetic-methylene blue solution after injection for intercostal block. Anesth Analg 75, 389–391.
18. Müller T (1998) Methylene blue supravital staining: an evaluation of its applicability to the mammalian brain and pineal gland. Histol Histopathol 13, 1019–1026.
19. National Toxicology Program (2008) Toxicology and carcinogen- esis studies of methylene blue trihydrate (Cas No. 7220–79–3) in F344/N rats and B6C3F1 mice (gavage studies). Natl Toxicol Program Tech Rep Ser 540, 1–224.
20. Portela DA, Castro D, Romano M et al., (2020) Ultrasound-guided erector spinae plane block in canine cadavers: relevant anatomy and injectate distribution. Vet Anaesth Analg 47, 229–237.
21. Presnell JK, Schreibman MP (1997) Humason’s Animal Tissue Techniques (5th edn). The Johns Hopkins University Press, USA. Р. 572.
22. Raymond SA, Steffensen SC, Gugino LD, Strichartz GR (1989) The role of length of nerve exposed to local anesthetics in impulse blocking action. Anesth Analg 68, 563–570.
23. Reina MA, Lopez A, Villanueva MC et al., (2000) Morphology of peripheral nerves, their sheaths, and their vascularization. Rev Esp Anestesiol Reanim 47, 464–475.
24. Risandiansyah R, Arniyati A, Nurita NI, Gionika NH (2020) The use of food coloring dyes in bacterial staining. J Exp Life Sci 10, 138–143.
25. Thies JA, Merrill SB, Corley EL (2002) Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. J Nematol 34, 179–181.
26. Thomson ACS, Diego AP, Romano M, Otero PE (2021) Evaluation of the effect of ultrasound guidance on the accuracy of intercostal nerve injection: a canine cadaveric study. Vet Anaesth Analg 48, 256–263.
27. Tousson EM, Al-Behbehani B (2010) Black Mulberries (Morus nigra) as a natural dye for nervous tissues staining. Egypt J Exp Biol Zool 6, 159–164.
28. Touzot-Jourde G, Geffroy O, Tallaj A et al., (2020) Ultrasonography-guided perineural injection of the ramus ventralis of the 7 and 8th cervical nerves in horses: a cadaveric descriptive pilot study. Front Vet Sci 7, 102.
29. U.S. Food & Drug Administration (2022) Summary of Color Additives for Use in the United States in Foods, Drugs, Cosmetics, and Medical Devices. https://www.fda.gov/industry/color- additive-inventories/summary-color-additives-use-united-states- foods-drugs-cosmetics-and-medical-devices. (Accessed 4 November 2023).
30. Vermeylen K, Hermans M, Soetens F et al., (2017) Opening injection pressure is higher in intraneural compared with perineural injections during simulated nerve blocks of the lower limb in fresh human cadavers. Reg Anesth Pain Med 42, 362–367.
31. Wittekind D (1979) On the nature of Romanowsky dyes and the Romanowsky-Giemsa effect. Clin Lab Haematol 1, 247e262.
32. Zilic L, Garner PE, Yu T et al., (2015) An anatomical study of porcine peripheral nerve and its potential use in nerve tissue engineering. J Anat 227, 302–314.
33. Zilic L, Wilshaw SP, Haycock JW (2016) Decellularisation and histological characterisation of porcine peripheral nerves. Bio-technol Bioeng 113, 2041–2053.

Источник: Veterinary Anaesthesia and Analgesia 2024, 51, 35e43.

СВМ№ 2/2024