Поиск

CRISPR-терапия справилась с миодистрофией Дюшенна у свиней

Миодистрофия Дюшенна — это генетическое заболевание человека, которым страдают в основном мальчики, поскольку соответствующий ген расположен на Х-хромосоме, а Y-хромосома не может компенсировать его дефект. У пациентов с болезнью Дюшенна производится аномальная версия белка дистрофина. В норме он прикрепляет мышечные клетки к волокнам внеклеточного вещества и отвечает за то, чтобы усилие от сокращения мышечных клеток передавалось на окружающие ткани. Мутантный белок с этой функцией справляется плохо, мышцы постепенно начинают работать «вхолостую», без видимого эффекта, и постепенно разрушаются. Как только дегенерация доходит до диафрагмы и сердечной мышцы, пациент погибает, поскольку лекарства от миодистрофии пока не существует.

Как и для других генетических заболеваний, для болезни Дюшенна учёные разрабатывают генную терапию, которая позволила бы исправлять ген прямо в клетках живого пациента. Для этого обычно используют систему «молекулярных ножниц» CRIPSR/Cas9, которую с помощью вирусных векторов вводят в кровь модельных животных. Этот метод отработали уже на мышах и собаках-биглях, теперь очередь дошла и до более близкого к человеку модельного объекта — свиньи.

Группа учёных под руководством Кристиана Купатта (Christian Kupatt) из Мюнхенского центра исследований сердечно-сосудистой системы воспроизвела миодистрофию Дюшенна на свиньях. Исследователи внесли в геном животных мутацию, которая полностью нарушила производство дистрофина. 61,6% таких животных умирали в первую неделю после появления на свет, а остальные жили дольше 105 дней. Причиной смерти, как правило, становилась аритмия.

В качестве терапии учёные подобрали гидовую РНК, которая направляет CRISPR/Cas9 на мутантную часть генома свиней. Затем CRIPSR/Cas9 вырезает этот участок, и клетки снова начинают производить дистрофин — укороченную, но функциональную его версию.

Для начала исследователи ввели гидовую РНК и CRISPR/Cas9 в переднюю и заднюю ноги 10-дневных поросят с одной стороны (вторая служила в качестве контроля). Через две недели они обнаружили, что в «экспериментальных» конечностях мышечные клетки начали производить дистрофин. В «контрольных» конечностях они тоже заметили экспрессию белка, но крайне слабую — судя по всему, это был просто результат «утечки» препарата вместе с кровью из «экспериментальных» ног. В ключевых для миодистрофии мышцах — сердечной и диафрагме — дистрофина не обнаружили.

Таким образом учёные продемонстрировали, что их препарат может работать в мышечной ткани. Чтобы распространить его действие на весь организм, они начали вводить его внутривенно. После этого дистрофин удалось обнаружить также в сердце и диафрагме, а животные стали более выносливыми физически. В то время как обычная свинья может провести на ногах около 400 минут, а больная дистрофией — немного более 200, то после генной терапии больные животные практически достигли контрольных значений.

Кроме того, у экспериментальных животных нормализовался сердечный ритм: и частота, и амплитуда, и мембранный потенциал клеток сердечной мышцы стали близки к контрольным. Наконец, после терапии свиньям удалось дожить до 136 дней, что примерно на треть больше срока, на который могут рассчитывать животные с дистрофией.

Мембранный потенциал в сердце свиней, вид спереди и сзади. Слева направо: здоровые животные, больные миодистрофией, свиньи после генной терапии. Фиолетовый – высокий потенциал, красный – низкий.

Учёные проверили, что их терапия не только эффективна, но и не вносит лишних повреждений в геном: по крайней мере, в пяти местах, где они ожидали найти следы нецелевого редактирования, их обнаружить не удалось. Поэтому они попробовали применить её и на клетках человека. В качестве модельного объекта исследователи взяли индуцированные плюрипотентные клетки (то есть клетки взрослого человека, репрограммированные до зародышевого состояния) — от больного миодистрофией и от здорового добровольца. Они обнаружили, что, в отличие от здоровых, мутантные клетки плохо дифференцируются в предшественники мышц. Но после обработки CRIPSR/Cas9 они становятся практически неотличимы от контроля (p < 0,0001) — ни по количеству образованных клеток-предшественников, ни по амплитуде сокращений. Следов нецелевого редактирования в них тоже не обнаружилось.

Источник: nplus1.ru