Биохимическое исследование гемостаза у собаки

Ж.Ф. Гелфи, А. Дидюлов

Биохимическое исследование гемостаза не часто используется ветеринарными врачами, потому что отсутствие «оценки нормы» вызывает сложности в интерпретации полученных результатов.

Гемостаз — это совокупность феноменов, обеспечивающих остановку геморрагий в случае повреждения сосудов, но исключающих возможность спонтанных кровотечений и формирования тромбов. Гемостаз определяется равновесным состоянием между функционирующими клетками эндотелия, выстилающими сосуды, тромбоцитами и факторами плазматической коагуляции.

В статье после экскурса в физиологию предлагается описание основных тестов при биохимическом исследовании гемостаза и показания к их проведению.

 

ФИЗИОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА

Под первичным гемостазом подразумевают плазматическую коагуляцию и фибринолиз.

Первичный гемостаз — это совокупность процессов при повреждении сосудов, которые завершаются образованием тромба, состоящего из тромбоцитов. Этого вполне достаточно для остановки кровотечения в капиллярах.

Если рана затрагивает сосуды крупных размеров, то первичный гемостаз усиливается «плазматической коагуляцией», и формируется плотный, нерастворимый сгусток фибрина, в котором содержатся эритроциты (красный тромб). Когда заживление сосудов завершено, то трансформация плазминогена в плазмин в результате воздействия ферментов (фибринолизин, тромболизин, триптаза) обеспечивает растворение тромба (фибринолиз).

Все эти феномены очень тесно взаимосвязаны, причем основную роль играют клетки эндотелия. Механизмы взаимоотношений представлены на рисунке 1. На рисунке 2 показана схема коагуляции, а в таблице 1 даются характеристики разных факторов, где каждый из них выполняет специфическую функцию. Восемь факторов относятся к зимогенам: они способны проявлять ферментативную активность и нуждаются в активировании (ХIII, прекалликреин, ХII, XI, X, IX, VII, II); три фактора выступают в качестве кофакторов ферментативных реакций (KHPM, V, VIIIC). Фибриноген является субстратом (фактор I). Кровь после серии стадий активации с фиксацией факторов на фосфолипидах трансформируется в плотную неподвижную массу — тромб. Фермент тромбин (фактор IIа), ответственный за формирование фибрина, образуется из протромбина (фактор II, неактивный предшественник) через комплекс протромбиназы с участием фактора Xa, Ca²⁺, фактора Va и тромбоцитарных фосфолипидов. Активация фактора X осуществляется через путь экстрансек (быстрый) и через путь интрансек (через «систему контактов»). В этом случае плазма вступает в контакт in vivo c сбэндотелиальным слоем сосудов и мембраной активированных тромбоцитов, in vitro взаимодействует со стеклом или другими активаторами (каолином). Три плазматических протеина: фактор XII, прекалликреин (PK, фактор Флетчера) и кининоген высокомолекулярный (KHPM, фактор Фитсжеральда) — вступают во взаимодействие для активирования фактора XI (XIa).

Рисунок 1. Взаимоотношения между первичным гемостазом, плазматической коагуляцией и фибринолизом.	Рисунок 2. Схема плазматической коагуляции.

Таблица 1. Факторы плазматической коагуляции (собака). Прекалликреин (PK) и кининоген с высокой молекулярной массой (KHPM) не указываются в данной таблице. Они представлены в тексте.

Название фактора	Номер фактора	Место синтеза	Поглощение или нет при коагуляции	Период полураспада	Роль
фибриноген	I	печень	да	2-4 дня	фибрин является субстратом
протромбин	II	печень с витамином К	да	3-4 дня	активируется в тромбин (II активированный), гидролиз фибриноген
проакселерин	V	печень и SMM	да	36-48 часов	является частью комплекса протромбокиназы
проконвертин	VII	печень с витамином К	нет	4 часа	VIIa + тканевый фактор активируют фактор X
антигемолитический фактор А	VIIIC	печень? эндотелиальные клетки	да	10-16 часов	VIIIC: коэнзим активирующий фактор X
антигемолитический фактор B	IX	печень с витамином К	нет	24 часа	вызывает активацию фактора IX, энзимактивирующий фактор X
фактор Стюарта	X	печень с витамином К	нет	36-48 часов	вызывает активацию фактора X, составляющего часть комплекса протромбиназы
фактор PTA	XI	печень?	незначительное поглощение	2-3 дня	дает XI активированный фактор, ферментативная активация фактора IX
фактор Хагемана	XII	печень?	слабое поглощение	48 часов	вызывает активацию фактора XII, ферментативная активация фактора XI
фактор, стабилизирующий фибрин	XIII	печень?	да	7 дней	вызывает активацию XIII фактора (трансаминаза)

Фактор XII активируется в фактор XIIa через KHPM; фактор XIIa активирует фактор XI и трансформирует прекалликреин в калликреин, который гидролизует KHPM, превращая его в кинины (брадикинин обладает свойствами вазодилататора).

С другой стороны, имеются физиологические ингибиторы коагуляции:

— антитромбин III (ATIII) ингибирует тромбин и фактор Xa; является кофактором гепарина (эндогенного и экзогенного);

— система, состоящая из тромбомодулина, протеина С и протеина S (тромбомодулин эндотелиальных клеток связывается с тромбином путем активации плазматического протеина С и ингибирует факторы Va и VIII в присутствии протеина S).

На рисунке 3 представлена схема фибринолиза. Плазминоген, синтезируемый печенью и SMM, трансформируется в протеолитический энзим плазмин. Эта активация осуществляется тремя эндогенными путями:

• тип экстрансек с включением тканевого активатора плазминогена (t-PA);
• тип интрансек с участием проурокиназы (pro-UK);
• путь взаимодействия с лейкоцитарными и тромбоцитарными протеазами.

Также возможна активация медикаментозными средствами (стрептокиназа, урокиназа).

Рисунок 3. Схема фибринолиза.

Плазмин, лизируя фибрин и фибриноген, вызывает образование продуктов деградации фибрина и фибриногена (ПДФ). Также он проявляет свою активность по отношению к другим факторам коагуляции (V, VIIIC и т.д.) и некоторым фракциям комплемента.

В системе фибринолиза имеются собственные ингибиторы: активации плазминогена, фиксации плазминогена к фибрину и антиплазмину (∝2-антиплазмин, (∝2-макроглобулин, антитромбин III и т.д.).

 

БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОСТАЗА

Исследование первичного гемостаза

В практических условиях ветеринарный врач располагает небольшим количеством биохимических тестов, необходимых для оценки состояния первичного гемостаза. В случае кровотечения клиницист может провести количественное и качественное (морфологическое) исследование тромбоцитов в мазках крови. Миелограмма также позволяет провести количественный и качественный морфологический анализ мегакариоцитов. Тестирование иммуноглобулинов позволяет выявить иммунологическую природу некоторых тромбоцитопений. Исследование адгезии и агрегации тромбоцитов осуществляют с помощью специальных лабораторных исследований, где также прибегают к количественному определению фактора Виллебранда.

Исследование плазматической коагуляции и фибринолиза

Существует много тестов, предназначенных для исследования плазматической коагуляции и фибринолиза. В данном случае мы описываем те, которые необходимы для контроля спонтанного патологического процесса у собаки.

Почти все они используются для анализа плазмы образца крови, обедненной тромбоцитами. Его получают методом быстрого центрифугирования (4000 оборотов в минуту в течение 5-10 минут) и консервируют с помощью цитрата натрия (4,5 мл крови + 0,5 мл 3,5% цитрата натрия). Результаты анализа сравнивают с таковыми плазмы здоровой собаки. Время с момента взятия образца крови до проведения теста не должно превышать 3-4 часа.

С помощью некоторых тестов исследуют общую коагуляцию плазмы. Использование других методов позволяет выявить только один фактор (аналитические тесты).

Хронометрическое исследование (время появления сгустка фибрина) остается наиболее приемлемым при работе с собаками.

Методы общего тестирования

♦ Время цефалина с активатором (temps de cephaline activateur, TCA)
Это время коагуляции плазмы крови, обедненной тромбоцитами, в присутствии суспензии фосфолипидного активатора кальция. Активатором может быть каолин (время цефалин каолин; temps de cephaline kaoline TCK). Результаты, полученные в клинической лаборатории в ветеринарной школе города Тулузы, варьируются в пределах 10-14 секунд. Этот тест не дает идеальной воспроизводимости, что вызывает необходимость использования в качестве контроля плазмы здорового животного. Время цефалина с активатором следует считать высоким, если соотношение показателей TCA больного/TCA контрольного превышает 1,3. В основном время цефалина с активатором определяется совокупностью факторов белковой природы (путь интрансек) и общего пути. Фактор VII и факторы тромбоцитов (фактор 3 и т.д.) не исследованы. На сегодняшний день часто используют менее чувствительный тест со временем Говелла (время рекальцификации плазмы, обогащенной тромбоцитами). Время Говелла у собаки определяют в интервале 45–75 секунд.

♦ Протромбиновое время, или время Квика (Temps de Quick, TQ)
Temps de Quick — это время коагуляции плазмы, обедненной тромбоцитами, в присутствии избытка тканевого фактора (тромбопластина) и кальция. Невозможно дать оценку референс контролю (стандартному контролю), потому что полученное время зависит от природы используемого тромбопластина. При использовании тромбопластина, полученного из экстракта головного мозга кролика, TQ у собаки варьируется в пределах 6-7 секунд, что значительно меньше, чем у человека. При использовании плазмы крови, разведенной в два раза (50%), TQ составляет 8 секунд. Нормальным результат считают в том случае, если ее показатель превышает 70%.

Протромбиновое время, или время Квика, отражает состояние экстрансекоидного и общего путей коагуляции плазмы. В частности, оно изменяется при снижении факторов комплекса протромбина (фактор II, V, VII и X). Выраженная гипофибриногенемия, как и циркуляция антикоагулянтов типа антипротромбиназы, может пролонгировать TQ. Данный метод слабо чувствителен к гепарину.

♦ Тромбиновое время
Это время коагуляции плазмы крови, обедненной тромбоцитами, при наличии тромбина. Результаты анализов, полученные в лаборатории ветеринарной медицины города Тулузы, варьируются в пределах 18-30 секунд при использовании бычьего тромбина, разведенного 1/20.

Показано, что тромбиновое время зависит от качества фибриногена и присутствия ингибитора (антитромбин, выраженное увеличение продуктов распада фибриногена и фибрина). В последнем случае тест не откорректирован в сравнении с контрольной плазмой.

♦ Аналитические тесты
С помощью хронометрических методов мы можем определять количественное содержание каждого фактора, участвующего в коагуляции плазмы. У собак ведут в основном поиск следующих факторов: I, II, V, совокупность VII+X, а также VIIIC и IX. Основной принцип этих тестов заключается в их простоте: определение времени коагуляции плазмы, смешивание плазмы больной собаки и коммерческой плазмы, которая содержит все факторы, за исключением тех, которые необходимо установить. Метод TQ используют в том случае, если речь идет о факторе экстрансекоидного или общего типа, а также о времени цефалина с активатором (факторе интрансекоидного типа). Полученные результаты оценивают в секундах и в процентном отношении к контрольной плазме собаки.

Фактор I (фибриноген) заслуживает особого внимания. Его можно определить с помощью различных методов. Хронометрический метод исследования основан на оценке активности физиологического фибриногена. При высокой концентрации тромбина и низкой фибриногена (разведенная плазма) имеется двойное логарифмическое соотношение между временем тромбина и фибриногенемии. Таким образом, мы исключаем влияние на данный процесс антитромбинов. Показатель нормы 2-4 г/л.

Продукты деградации фибриногена или фибрина (ПДФ), которые свидетельствуют о тромболизе или первичном фибринолизе, обнаружены у собаки. Количественное определение продуктов распада фибриногена или фибрина, осуществляемое методом полуколичественного анализа с применением латекса, основывается на агглютинации факторов ПДФ с частицами латекса, сенсибилизированными сывороткой анти-ПДФ.

Как показали первые исследования, «ПДФ-плазма» (лаборатория Stago) не вызывает сомнения в перспективности использования ее для собаки.

Обычно плазматическая концентрация продуктов распада фибриногена или фибрина менее 10 мкг/мл. В плазме можно обнаружить растворимые комплексы мономеров фибрина и фибриногена, а также продуктов распада фибриногена или фибрина. F.S. — это тест (лаборатория Stago), который основан на использовании эритроцитов, покрытых мономерами фибрина. Присутствие растворимых комплексов определяется методом полуколичественного анализа гемагглютинации (от – до +++). Это очень чувствительный тест.

Подсчет количества тромбоцитов (кровь, полученная в смеси с ЭДТА) не является в строгом смысле слова наиболее значимым показателем при оценке плазматической коагуляции. При активации коагуляции тромбоциты могут перемещаться в область формирования тромба, и их количество в циркулирующей крови снизится.

Необходимо отметить, что снижение количества антитромбина III (ATIII) в основном возникает при активации коагуляции, недостаточности печени или нефротическом синдроме. У собаки количественное определение путем добавления в плазму гепарина, тромбина и измерения активности остаточного тромбина за счет его действия на субстрат оценивают, как и у человека. Результат определяют как процентное отношение к контрольной плазме (от 80 до 120%). Следовательно, описанные ранее методы оценки фибринолиза основаны на поиске «поглощенных» и/или лизированных факторов за период активации коагуляции, сопровождающейся фибринолизом (фактор V, VIIIC, фибриноген, тромбоциты и т.д.), или на обнаружении продуктов фибринолиза (продукты распада фибриногена или фибрина, растворимые комплексы). В данном случае речь идет о непрямых тестах, позволяющих выявить высокий уровень фибринолиза.

Имеются и прямые тесты, с помощью которых можно охарактеризовать обычно протекающий фибринолиз.

Здесь мы остановимся на методах, которые можно использовать для исследования собаки: время лизиса сгустка в плазме (например, после времени Говелла), время лизиса тромба, образованного эуглобулинами (von Kaulla), количественное определение плазминогена и t-PA, а также проурокиназы, специфических ингибиторов t-PA и антиплазминов.

Для оценки гемостаза необходимо располагать следующим материалом:

• кровь, взятая с ЭДТА (2,5 мл) для количественного определения тромбоцитов;

• кровь, взятая с цитратом натрия (4,5 мл достаточно для проведения всех тестов). Использование крови здоровой собаки дает возможность провести сравнительный анализ для выявления незначительного удлинения времени TQ и кефалина с активатором. При этом можно использовать заготовленные фракции аликвот из пула плазмы крови, консервированной методом заморозки.

 

ПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕМОСТАЗА

Исследование гемостаза показано для идентификации причины кровотечения, оценки воздействия различных патофизиологических фактов, проведения адекватной терапии.

Биохимическое исследование крови

Когда причина кровотечения не совсем понятна, то клиницист в решении данной проблемы применяет общий подход, ориентируясь на практическое руководство.

Оценка эффектов различных патологических факторов

При многих нарушениях или заболеваниях следует использовать разные тесты, позволяющие оценить гемостаз. Это имеет большое значение для диагностики и поиска адекватного лечения. К таким состояниям относятся:

— Синдром внутрисосудистой коагуляции (ВК), который может быть более или менее компенсированным, в том числе при онкологических заболеваниях, гипергемолизе, заболеваниях печени и т.д. При общем исследовании, которое позволяет определить интенсивность процесса, определяют: время взаимодействия цефалина с активатором, время Квика, количественное определение фибриногена, обнаружение ПДФ и получение гемограммы. Такой подход также применяют до и после некоторых хирургических операций (на грудной клетке, матке, селезенке, у животных, подверженных нарушению печени, в частности, перед проведением биопсии и т. д.).

— Недостаточность синтеза белков плазматической коагуляции может быть вызвана заболеваниями печени. Тemps de Quick рассматривается как хороший тест на гепатоцеллюлярную недостаточность, в частности, при острых течениях заболевания. Тем не менее, трудно установить причину снижения количественного содержания фактора в крови, потому что феномены, связанные с недостаточностью его синтеза и степенью поглощения при диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВС), часто ассоциируются.

— Тенденция к развитию тромбоза встречается при снижении фактора ATIII в связи с недостаточностью его синтеза (нарушения печени), потерями в пищеварительном тракте и в основном через мочу. Несмотря на нефротический синдром, при котором ATIII, белок с низким молекулярным весом (м.в. 65 000), элиминируется с мочой в большом количестве, участие других протеинов в коагуляции крови не изменяется. Но следует заметить, что риск тромбоза при этом особенно повышается.

Оценка лечения

Для того, чтобы оценить время снятия интоксикации путем воздействия на субстанции, на которые активно влияет витамин К, можно использовать следующую схему лечения: витамин К (5 мг/кг/сутки) назначают минимум в течение трех недель, затем делают перерыв сроком на 48 часов и проводят исследование на TQ. Если этот показатель остается высоким (≤ 70%), то лечение продолжают в течение 10 дней. Время Квика также используют для оценки состояния тромбозов при применении препаратов кумарина. Вероятно, оно должно быть стабильно высоким (50%). Назначение гепарина в случае ДВС синдрома должно сопровождаться нормализацией времени взаимодействия цефалина с активатором (и снижением плазматических ПДФ). Определение общего ATIII позволяет провести оценку вначале лечения: содержится ли он в достаточном количестве в плазме крови (ATIII менее 50%) или нет, чтобы обеспечить действие гепарина.

 

ОСНОВНЫЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ, НАБЛЮДАЕМЫЕ У СОБАКИ

Два общих базовых теста (время цефалина с активатором и TQ) не изменяются в случае выраженных нарушений количественных показателей плазматической коагуляции при повышенном времени свертывания.

Время цефалина с активатором является единственным тестом, который используют при определении наследственного дефицита факторов, действующих по интрансекоидному пути. Его используют в следующих случаях:

1. VIIIC (гемофилия тип А и некоторые случаи заболевания Виллебранда);
2. IX (гемофилия тип B, встречается редко) в присутствии антикоагулянтов, циркулирующих в крови (не полностью расшифрована у собаки), и при лечении препаратами гепарина.

Время цефалина с активатором и TQ удлиняется по следующим причинам:

1. Наследственный дефицит факторов: X, V, II и I (редко встречаются).
2. Интоксикация, вызываемая родентицидами – антивитаминами К (часто сопровождается относительным удлинением времени цефалина с активатором и TQ).
3. Выраженное внутрисосудистое диссеминированное свертывание (ДВС) (некоторые новообразования, отравления змеиным ядом, ангиостронгилез и дирофиляриоз).
4. Острое течение заболевания печени.
5. Циркулирующие антикоагулянты.
6. Гепатотерапия в больших дозах.

Temps de Quick — это единственный тест, который указывает на удлинение времени свертывания крови при дефиците фактора VII (редко встречается).

Время тромбина удлиняется при сильном снижении фибрина в крови (редкие наследственные заболевания, выраженная недостаточность печени, ДВС по причине снижения фибрина), а также если антитромбины в большом количестве циркулируют в крови (продукты распада фибриногена или фибрина, дисглобулинемии и т.д.).

У собаки часто наблюдают изменение коагуляции в связи с воспалением, ее активацию вследствие реакционного фибринолиза. Тесты, определяемые при общем исследовании, не нарушаются. Возможна гиперфибриногенемия, снижение фактора V, изменение количества тромбоцитов в случае реакционного гиперфибринолиза у биологических стигматов (продукты распада фибриногена или фибрина и растворимые комплексы).

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гемостаз — совокупность комплекса феноменов. Тем не менее, его можно исследовать на практике с помощью нескольких относительно простых тестов. Существует препятствие, связанное с отсутствием четкой оценки нормы при посылке материалов в лабораторию. Поэтому в случае необходимости исследуют плазму у больных собак в сравнении с показателями здоровой собаки, плазму которой консервируют путем заморозки в соответствующих аликвотах (количествах).

Опираясь на полученные результаты, клиницист может идентифицировать причину кровотечения или наличие факторов, свидетельствующих о патологическом процессе. Это позволяет провести адекватную терапию.

СВМ 5/2004
Илл. freepik.com