Обзор различных диагностических методик для выявления паразитарных инфекций ЖКТ у собак

Breno Barros de Santana¹, Tallys Leandro Barbosa da Silva¹, Rafael Antonio Nascimento Ramos^2,3, Leucio Câmara Alves², Gilcia Aparecida de Carvalho^1
1 Unidade Acadmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Garanhuns, Brazil.
² Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Brazil.
³ Dipartimento di Medicina Veterinaria, Universit degli Studi di Bari, Bari, Italy.

Резюме

Кишечные нематоды — одни из самых распространённых кишечных паразитов у собак, а Toxocara spp. и Ancylostoma spp. представляют угрозу также и для общественного здравоохранения в связи со своим зоонозным потенциалом. В этой статье представлен обзор трёх диагностических техник, позволяющих выявить яйца/ооцисты желудочно-кишечных паразитов у собак. Для исследования были собраны образцы кала из окружающей среды (публичные места, парки, улицы и дворовые территории) в городе Гараньюнс (штат Пернамбуку, Бразилия). Образцы анализировались с помощью простой техники флотации Уиллиса–Моллея, спонтанной седиментации (Hoffman, Pons and Janer) и модифицированной техники флотации в центрифуге. Среди подвергшихся анализу образцов, 56,49% (161/285) оказались положительны на яйца и/или ооцисты кишечных паразитов. В частности, 44,21% (126/285) были выявлены с помощью техники Уиллиса, 45,14% (121/268) — методом флотации в центрифуге и 31,57% (90/285) методом Хоффмана. Коэффициент Каппа Коэна показал хорошую согласованность методов флотации в центрифуге и Уиллиса (k = 0,625), удовлетворительную согласованность между методами Хоффмана и Уиллиса
(k = 0,480) и методами Хоффмана и флотации в центрифуге (k = 0,433). В целом метод флотации в центрифуге показал высокую чувствительность к Ancylostoma spp. и Toxocara spp. (наиболее часто встречавшиеся паразиты в этом исследовании), и он может применяться в комбинации с техникой Уиллиса, чтобы обезопасить конечной диагноз от погрешностей в ходе рутинной лабораторной диагностики.

Вступление

Паразитарные заболевания являются одними из самых опасных зоонозных инфекций по всему миру и считаются серьёзной угрозой для социоэкономического равновесия, в особенности в развивающихся странах [1]. К примеру, паразиты собак, такие как Toxocara spp. и Ancylostoma spp., создающие в организме фон для висцерального и кожного вида гельминтоза larva migrans, имеют огромное санитарное значение [2, 3].

Несмотря на наличие широкого спектра терапевтических и профилактических мер, доступных в наше время, яйца и ооцисты паразитов довольно часто выявляются в кале собак, а их элиминация в окружающую среду является для паразитов путём передачи к новому хозяину, в т. ч. людям [4, 5]. Большинство этих кишечных паразитов (т. е. Toxocara spp., Ancylostoma spp. и Cystoisospora canis) распространены в основном в городских и пригородных областях, в тропических зонах с неадекватными санитарными условиями [6, 7]. В настоящее время, в связи с ростом количества семей, в которых есть собаки, число людей, подверженных риску паразитарной зоонозной инфекции также увеличивается [2].
В то же время человеческие инфекции представляют риск не столько в домашней обстановке, сколько в общественных местах (парки, улицы и т. д) [8–12].

Методы диагностики паразитарных инфекций применяются для выявления кишечных паразитов путём выявления различных паразитарных форм (яйца, личинки, ооцисты или трофозоиды), которые выводятся с калом. Несмотря на прогресс лабораторной техники и преимущества молекулярного тестирования, паразитологические методы всё ещё играют важную роль в здравоохранении, в основном благодаря своей простоте и низкой стоимости [13–15]. Однако, поскольку диагностика основывается на выявлении яиц или ооцист, подтверждение в некоторых случаях может представлять сложности [6]. Кроме того, выбор наиболее удобного для рутинного использования в условиях лаборатории может стать препятствием для эффективной диагностики. В связи с этим, целью данного исследования стала оценка трёх разных техник (техника флотации Уиллиса–Моллея, спонтанной седиментации Хоффмана, Понса и Дженер, модифицированная техника флотации в центрифуге) выявления яиц/ооцист кишечных паразитов собак.

Материалы и методы

Сбор образцов

С августа 2011 по июль 2012 года образцы собачьих экскрементов (n = 285) собирались в общественных местах (улицы, парки и дворовые территории) в городе Гараньюнс, штат Пернамбуку, Бразилия. Собранные образцы помещались в пластиковые контейнеры, подписывались и хранились в изотермальных боксах при температуре 4°C вплоть до обработки в лаборатории.

Лабораторные процедуры

Все образцы анализировались с помощью трёх разных техник для выявления яиц и ооцист: 1) техники флотации Уиллиса–Моллея [16]; 2) спонтанной седиментации Хоффмана, Понса и Дженер [17]; 3) модифицированная техника флотации в центрифуге [18]. Далее в тексте методы будут обозначаться как техники Уиллиса, Хоффмана и флотации в центрифуге.

После приготовления препаратов для каждой техники, все образцы помещались на стёкла с добавлением 2% раствора Люголя и направлялись на исследование под микроскопом под различными увеличениями (10× и 40×). Яйца и ооцисты выявлялись описанным ранее методом [19, 20].

Таблица 1. Инвазии и коинвазии, выявленные с помощью каждой техники диагностики кишечных инвазий собак, среди образцов экскрементов собак, собранных в районе города Гараньюнс

Анализ данных

Анализ данных на основании коэффициента Каппа Коэна был проведён для сравнения результатов тестов. Значения Каппа были интерпретированы в соответствии с принятой схемой [21]. При оценке чувствительности, специфичности, положительной прогностической значимости (positive predictive value; +PV), отрицательной прогностической значимости (negative predictive value; –PV) и точности техника Уиллиса принималась в качестве золотого стандарта [22]. Для расчёта параметров использовалось программное обеспечение Bioestat 5.0 и Epi-Info.

Результаты

Из 285 образцов яйца/ооцисты кишечных паразитов были выявлены в 56,49% (161/285) случаев: 44,21% (126/285) — с помощью техники Уиллиса, 45,14% (121/268) — методом флотации в центрифуге и 31,57% (90/285) — методом Хоффмана. Все результаты о найденных с помощью каждой техники инвазиях и коинвазиях приведены в таблице 1.

Стоит отметить, что Ancylostoma spp. и Toxocara spp. выявлялись чаще всего, независимо от используемого метода. Средние количества найденных яиц/ооцистов с помощью всех техник указаны в таблице 2.

Таблица 2. Абсолютная и относительная частота, среднее количество яиц и стандартное отклонение оценки кишечных паразитов, выявленных в образцах экскрементов собак, собранных в районе города Гараньюнс

С помощью анализа Каппа Коэна были получены следующие результаты: Уиллис vs техника флотации в центрифуге (k = 0,625; P <0,001) — хорошая согласованность; Уиллис vs Хоффман (k = 0,480; P < 0,001) — удовлетворительная согласованность; флотации в центрифуге vs Хоффман (k = 0,433; P < 0,001) — удовлетворительная согласованность. Чувствительность, специфичность, +PV, –PV и точность описаны в таблице 3.

Обсуждение

В этом исследовании были оценены три разные диагностические методики (Уиллиса, Хоффмана и флотации в центрифуге). Результаты демонстрируют разницу между методами, в особенности это касается процента положительных результатов — 44,21% (126/285), 45,14% (121/268) и 31,57% (90/285), для Уиллиса, Хоффмана и техники флотации в центрифуге соответственно. Хотя разница и незначительна, она даёт представления о специфических свойствах каждого метода.

Таблица 3. Оценка техник флотации в центрифуге и спонтанной седиментации Хоффмана в сравнении с техникой Уиллиса (золотой стандарт) в диагностике кишечных паразитов, в образцах экскрементов собак, собранных в районе города Гараньюнс

Среди выявляемых паразитов чаще всего встречалась Ancylostoma spp., а также Toxocara spp. и Trichuris spp. Эти результаты согласуются с результатами предыдущего исследования, проводившегося в штате Санта Катарина, где Dipylidium caninum, Toxocara canis и Trichuris vulpis были самыми выявляемыми видами [23].

Самая высокая относительная частота во всех методиках была у Ancylostoma spp. (63,74% к 88,76%). С другой стороны, Toxocara spp. была самым выявляемым паразитом при использовании техники Хоффмана (35,77%), по сравнению с техниками Уиллиса и флотации в центрифуге, при которых средняя частота выявления этого паразита составила менее 20%. В отличие от других паразитов, относительная частота выявления яиц Trichuris spp. и Strongyloides spp. составила менее 1%. Последнее было установлено только благодаря модифицированной методике флотации в центрифуге. Любопытно, что большие количества яиц, выявляемые в некоторых случаях (к примеру, в одном случае с помощью флотации в центрифуге было найдено 336 яиц Toxocara spp. и 200 Ancylostoma spp.), выявили острую паразитарную инфекцию и лишний раз подчеркнули важность правильного выбора метода диагностики гельминтозов.

Приняв технику Уиллиса за золотой стандарт, чувствительность и специфичность в 79 и 85% соответственно были достигнуты в диагностике Ancylostoma spp., что говорит о хорошем результате, согласно коэффициенту Каппа Коэна (0,625). В то же время метод Хоффмана показал схожее значение специфичности (89%), но уступил в чувствительности (54%).

Флотация в центрифуге выявляет концентрацию яиц путём нескольких последовательных смывов, таким образом позволяя идентифицировать их. При этом методе наблюдалась высокая специфичность (98%) и чувствительность (80%) в выявлении Toxocara spp. С другой стороны, метод Хоффмана продемонстрировал чувствительность и специфичность в 67 и 100% соответственно. Для обоих этих тестов коэффициент Каппа Коэна составил 0,48, что говорит об удовлетворительной точности результатов. Таким образом, это указывает на необходимость проводить эти тесты параллельно с целью повысить эффективность выявления токсокарид.

В целом техники Уиллиса и флотации в центрифуге показали хорошую воспроизводимость; к тому же обе техники выявили большое количество яиц Ancylostoma spp. и Toxocara spp. Разница в чувствительности и специфичности проистекает из их индивидуальных особенностей, и она может увеличиваться в зависимости от конкретного паразита [24]. В этом контексте рекомендуется проводить анализ кала с помощью более чем одной техники. Использование одного метода может не выявить реальную ситуацию паразитарной инфекции, особенно учитывая то, что у животных зачастую присутствуют смешанные инвазии.

Заключение

Для достижения надёжного диагностического результата метод флотации в центрифуге, который показал высокую чувствительность к Ancylostoma spp. и Toxocara spp. (самым распространённым кишечным инвазиям), может быть использован в совокупности с техникой Уиллиса в протоколе рутинной лабораторной диагностики.

Источник: Open Journal of Veterinary Medicine, 2015, 5, 19–24. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/