Патологоанатомические изменения у метиса таксы с нейроаксональной дистрофией

Davide Pintus1, Maria Giovanna Cancedda1, Simona Macciocu1, Claudia Contu1 and Ciriaco Ligios1
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna «G.Pegreffi»

 

 

Введение

 

Нейроаксональная дистрофия (НАД) представляет собой группу наследственных или приобретённых нейродегенеративных состояний, поражающих человека и животных и характеризующихся наличием большого количества увеличенных в объёме аксонов (сфероидов) в центральной и, реже, периферической нервной системе.

Аксональные сфероиды у собак [1] и кошек [2], поражённых НАД, часто выявляются в сочетании с другими изменениями, такими как церебральная атрофия, характеризующаяся значительным уменьшением клеток Пуркинье [3; 4].

Несколько работ сообщали о том, что НАД является аутосомным рецессивным расстройством, и некоторые породы собак имеют явную предрасположенность к НАД [5; 6]. Наиболее часто страдающей породой являются ротвейлеры [3], хотя НАД была описана также и у джек-рассел-терьеров [7], колли [8], чихуахуа [9] и папильонов [10]. Что касается других видов животных, о небольшом числе случаев сообщалось в отношении овец [11], кошек [2] и енотов [12], при этом у людей, страдающих болезнью Галлервордена — Шпатца и синдроме Сейтельбергера выявляются признаки, сходные с таковыми при НАД у животных-компаньонов. Как приобретённое состояние НАД может также появляться при хроническом дефиците витамина E, инсулин-зависимом диабете и воздействии некоторых токсинов [13; 14].

Механизмы появления сфероидов при НАД выяснены только частично, но иммуногистохимические методы показывают, что НАД вызывает скопление синапс-ассоциированных белков, цитоскелетных белков и других аксональных маркёров, таким образом приводя к дефициту аксональной передачи как основной причины формирования сфероидов [15].

В данной статье мы описываем случай НАД у щенка — метиса таксы с исключительным и специфическим нейрораспределением по нервной цепи, участвующей в передаче сознательной проприоцептивной информации.

 

Разбор клинического случая

 

У двух щенков — метисов таксы из одного помёта развивалось прогрессирующее нарушение ходьбы, начиная с возраста в несколько недель. Один щенок был эвтаназирован без посмертной диагностики, в то время как другой был представлен для клинического осмотра в возрасте 1 год. Неврологический осмотр выявил гиперметрию, дефицит проприорецепции и необратимую атаксию, в первую очередь, задних конечностей. Мышечный тонус, масса и сила мышц были в норме, высшая психическая деятельность оставалась полноценной. Собака была эвтаназирована по соображениям гуманности в силу некурабельной природы прогрессирующего заболевания.

При вскрытии были отобраны головной мозг, спинной мозг, тяжи седалищного нерва, а также образцы мышц конечностей, печени и почек и сразу же зафиксированы 10% нейтральным буферизованным формалином. Были сделаны коронарные срезы с шести различных участков головного мозга (базальные ядра, таламус, средний мозг, мост, продолговатый мозг, мозжечок), а также на уровне выхода каждого спинномозгового нерва, затем они были обычным образом обработаны и зафиксированы парафином. Из вырезанных участков в парафиновых блоках были сделаны серийные срезы толщиной 5 мкм и затем окрашены гематоксилин-эозином, модифицированным реактивом Шиффа-Пикро индиго кармин для реакции по Морелу — Маронгеру (PAS-M.M.), люксолом быстрым синим по Клювер-Барреру (KB) и красителем Perl. Далее были проведены доскональные иммуногистохимические исследования отобранных срезов тканей с использованием специфических первичных антител к следующим маркёрам аксонального транспорта: тонким полипептидным нейрофиламентам (NF-L) и тау, цитоскелетным белкам; убиквитину, белку «теплового удара»; синаптофизину, белку, связанному с синапсами; глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), специфическому маркёру астроцитов (таблица 1). Для исследования потенциальной роли аутофагальных механизмов образования сфероидов использовались специфические первичные антитела к аутофагосомальному ассоциированному с микротрубочками белку 1, лёгкая цепь 3 бета (MAP1LC3B) (таблица 1). Первичные антитела всегда выдерживались в течение ночи при 4 C, иммунореактивность определялась биотин-авидин-пероксидазным методом с использованием 3,3-диаминобензидина в качестве хромогена. Дополнительные технические детали приведены в таблице 1. Поперечные и продольные срезы седалищного нерва, а также срезы мышц, печени и почек были тоже зафиксированы парафином, из парафиновых блоков были сделаны серийные срезы толщиной 5 мкм и окрашены гематоксилин-эозином. Наконец, срезы седалищного нерва также были окрашены иммуногистохимически к GFAP и гистохимически к миелину с использованием KB-техники. Были получены иммуногистохимические отрицательные контроли с исключением первичных антител и использованием тканей головного мозга двух помесных собак возрастом 6 месяцев и 1 год.

 

Таблица 1. Технические детали

 

Первичное антитело

Хозяин

Разведение

Восстановление антигена

Производитель (кодовый номер)

Нейрофиламенты (NF-L)

Мышь

1:800

Цитратный буфер 0,01 M pH 6,0
(3×5 мин. на 750 В)

Dako, Carpinteria, CA (M 0762)

Синаптофизин

Мышь

1:25

Цитратный буфер 0,01 M pH 6,0
(3×5 мин. на 750 В)

Dako, Carpinteria, CA (M 0776)

Убиквитин

Кролик

1:150

Нет

Dako, Carpinteria, CA (Z0458)

Тау

Кролик

1:100

Цитратный буфер 0,01 M pH 6,0
(3×5 мин. на 750 В)

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO (T5530)

Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)

Кролик

1:100

Нет

BIOGENEX, Freemont, CA (932-020 M-4)

LC3B

Кролик

1:800

Цитратный буфер 0,01 M pH 6,0
(3×5 мин. на 750 В)

Abcam, Cambridge, UK (Ab 48394)

 

 

Илл. 1. Распространение аксональных сфероидов. Иллюстрация срезов головного и спинного мозга, демонстрирующая пучки и ядра со сфероидами по всей центральной нервной системе.
Срезы головного мозга: красные зоны — вентральное заднелатеральное ядро таламуса;  жёлтые зоны — медиальная петля; бирюзовые зоны — тонкое ядро; синие зоны — медиальное клиновидное ядро.
Срезы спинного мозга: бирюзовые зоны — тонкий пучок; синие зоны — клиновидный пучок.

 

 

Илл. 2. Микрофотографии гистологических структур. Срез продолговатого мозга показывает медиальные клиновидные ядра (a). Присутствие ряда эозинофильных аксональных сфероидов размером 3–50 мкм (треугольная стрелка), некоторые из них вакуолизированы (вторая стрелка). Грудной отдел спинного мозга (b). Продольные срезы тонкого и клиновидного пучков показывают «пищеварительные камеры» с аксональными остатками и отдельными макрофагами (звёздочка). Гематоксилин-эозин. Мерная черта = 100 мкм

 

 

При вскрытии не было выявлено макроскопических изменений. Гистологическое исследование на всём протяжении центральной нервной системы (ЦНС) показало билатеральную симметричную нейроаксональную дистрофию, что нехарактерно для вентрального заднелатерального ядра таламуса, медиальной петли, тонкого ядра и медиального клиновидного ядра головного мозга. Такие же изменения в спинном мозге были обнаружены в тонком и клиновидном пучках, в особенности в грудном отделе (илл. 1). На поперечных срезах нейроаксональные изменения характеризовались аксональными сфероидами размером 3–50 мкм, имеющими форму от круглой до овоидной и окрашивавшимися эозинофильно от слабой до интенсивной степени (илл. 2а).

На продольных срезах тонкого и клиновидного пучков были обнаружены признаки дегенерации, сходной с валлеровой, включая т. н. «пищеварительные камеры» (digestion chambers; термин принят в англоязычной литературе для обозначения вакуолярных образований, содержащих шаровидные фрагменты миелина и аксоплазмы — прим. ред.), содержащие спорадические макрофаги и аксональные остатки (илл. 2b). Изредка сфероиды обнаруживались в дорсальном роге спинного мозга.

Гистохимическое окрашивание обнаруживало, что некоторые сфероиды содержали PAS-M.M-позитивный материал, а KB-окрашивание обнаруживало относительно сохранившийся миелин. Краситель Perl не выявлял присутствия железа в каких-либо участках головного мозга.

Во всех срезах из ЦНС сфероиды проявляли иммунореактивность к NF-L, тау, синаптофизину и убиквитину, более интенсивный сигнал проявлялся на уровне спинного мозга (илл. 3). Кроме того, иммуногистохимический анализ к белку LC3B выявил интенсивные скопления аутофагосом внутри сфероидов (илл. 3).

Наконец, иммуногистохимический анализ к GFAP подтвердил наличие несомненного астроглиоза и астроцитоза в ядрах наблюдаемых сфероидов. Срезы с мышц, печени, почек и седалищного нерва были гистологически нормальными. Как и в контроле, у больной собаки наблюдалась слабая GFAP-иммунореактивность с линейной структурой в продольных срезах седалищного нерва (илл. 4). Также в седалищном нерве не наблюдалось демиелинизации при использовании KB-красителя.

На основании клинических, гистопатологических и иммунохимических особенностей была диагностирована НАД.

 

 

Илл. 3. Микрофотография, показывающая иммуногистохимическую реактивность аксональных сфероидов. Поперечные срезы грудного отдела спинного мозга (тонкий и клиновидный пучки) щенка, поражённого НАД, показывают многочисленные сфероиды, иммуногистохимически реактивные (ИР) к нейрофиламентам (a), тау (c), синаптофизину (e), убиквитину (g), и LC3B (i). Как и ожидалось, единичные сфероиды были обнаружены и у здоровой собаки (b, d треугольная стрелка), в то время как LC3B ИР наблюдаются в глиальных клетках и больной, и здоровой собаки (i, j). Синаптофизин также был выявлен в нейропиле контрольного животного (f). Авидин-биотин-пероксидазный комплексный метод с контрастирующим окрашиванием Мейеровским гематоксилином. Мерная черта = 100 мкм

 

 

Илл. 4. Микрофотографии иммуногистохимической реактивности седалищного нерва. Седалищный нерв собаки, поражённой НАД (a) и здоровой контрольной собаки (b). Продольный срез седалищного нерва показывает слабую линейную иммуногистохимическую реактивность к GFAP как у больной (a), так и у здоровой собаки (b). Авидин-биотин-пероксидазный комплексный метод с контрастирующим окрашиванием Мейеровским гематоксилином. Мерная черта = 100 мкм

 

 

Выводы

 

При НАД структура распространения сфероидов варьирует, они занимают значительные участки серого и белого вещества головного и спинного мозга вместе с тонким ядром и клиновидным ядром, при этом дорсальный рог спинного мозга поражается постоянно и преимущественно [3].

До сих пор сообщалось о широко распространённых и выявляемых по всей ЦНС поражениях при НАД у щенков папильонов [10], ротвейлеров [3; 16] и джек-рассел-терьеров. Интересно, что у щенков чихуахуа сфероиды обнаруживались, главным образом, в белом веществе головного мозга [9]. Что касается спинного мозга, распространение сфероидов у собак в случаях НАД наблюдалось во всех пучках шейного, грудного и поясничного отделов спинного мозга [4; 9]. Наблюдались другие изменения, такие как сниженное число мозжечковых клеток Пуркинье [16]. В целом, эти исследования показывают: несмотря на то, что аксональные сфероиды при НАД присутствуют в большом количестве нервных ядер и пучков, поражение, имеющее значение и ограниченное только одной специфической нервной цепью, до настоящего времени описано не было. В противоположность этому, главная особенность данного случая — исключительная и специфическая локализация в нейронной цепи, вовлечённой в процесс передачи сознательной проприоцептивной информации.

Предыдущие работы, касающиеся НАД, выявили иммунопозитивную реакцию сфероидов на некоторые связанные с синапсами белки, в т. ч. синаптофизин, а также другие молекулы, такие как NF-L, тау и убиквитин [15; 17]. Эти находки показывают наличие аберантной локализации интегральных синаптических пузырьков, связанных с синаптическими пузырьками пресинаптических плазматических мембран и цитоплазматических белков, участвующих в везикулярном нейромедиаторном транспортном потоке [15; 16; 17]. Что касается иммуногистохимических реакций к белку LC3B, наши результаты подтверждают, что нарушение путей нейрональной аутофагии играет роль в патогенезе образования сфероидов. Это было выявлено недавно у поражённых НАД испанских водяных собак, у которых заболевание связывалось с мутацией гена тектонин бета-пропеллерного повтор-содержащего белка 2 [6], который принимает участие в процессах аутофагии, аксонального транспорта и митохондриальном механизме.

Скопление железа внутри сфероидов и за их пределами — характерная особенность заболевания людей болезнью Галлервордена — Шпатца. Тем не менее, нейронных скоплений железа не было обнаружено ни в нашем исследовании, ни в работах касательно случаев НАД у других домашних животных [15], что, таким образом, исключает аналогию с этим заболеванием у животных.

Иммуногистохимические особенности, выявленные в настоящем клиническом случае НАД, находятся в полном соответствии с таковыми, ранее выявленными у собак другими исследователями; тем не менее, распространение повреждений в настоящем случае остаётся отличным от большинства случаев нейроаксональной дистрофии, о которых сообщалось ранее.

Подобное распространение аксональных сфероидов было задокументировано также и у других видов. У кошек вакуолизация и сфероиды описаны в тонком и клиновидном пучках, но также были незначительно поражены дорсо-латеральные, вентральные и вентро-медиальные пучки спинного мозга [2].

До последнего времени считалось, что аксональная дистрофия при НАД обнаруживает широкое распространение в ЦНС, включая различные нейронные пути, а не только сенситивные. В нашем случае имела место топографически отличная от описанной патологическая организация, характеризующаяся повреждениями, локализованными исключительно в чувствительных аксонах, отвечающих за общую сознательную проприоцептивную информацию, которая движется от механорецепторов к первичной соматосенсорной коре больших полушарий через тонкий и клиновидный пучки и медиальное клиновидное ядро, медиальную петлю и вентральное заднелатеральное ядро таламуса. Фактически клинические неврологические симптомы больного щенка отражали локализацию наблюдавшихся поражений, находились с ней в полном соответствии. Дорсальный столб спинного мозга несёт большую часть информации о тактильных распознаваниях и проприорецепции и заканчивается примыканием к тонкому и медиальному клиновидному ядрам. Повреждения дорсального столба спинного мозга у приматов препятствуют возможности воспринимать тактильные раздражения и ухудшают способность чувствовать положение конечности в заданном пространстве [18]. В нашем случае гистологическое и иммуногистохимическое исследования седалищного нерва показывали, что в процесс не вовлекается периферическая нервная система. Фактически, GFAP без сомнения проявляется в шванновских клетках нервов, если они повреждены [19].

Хотя в описываемом случае НАД не было обнаружено доказательств наследственного характера патологии, генетическое нарушение может быть допущено из-за врождённого проявления, а также наличия другого больного щенка из того же помёта. Интересно, что наш случай также является первым, в котором описывается данная патология у кроссбредной собаки. Наконец, наша работа говорит о необходимости более систематических попыток определения и тщательного описания всех клинических и патологических проявлений НАД. Литература говорит о том, что широкий спектр патологоанатомических изменений, которые широко варьируют среди разных видов и пород от случая к случаю, обычно все определяются как НАД. Может быть полезным вклад в более тщательную и систематическую диагностику ЦНС для определения подтипов НАД на основе локализации поражений и в соответствии с неврологической симптоматикой.

 


Сокращения

ЦНС — центральная нервная система; GFAP — глиальный фибриллярный кислый протеин; INAD — болезнь Зейтельбергера; KB — люксол быстрый синий по Клювер-Барреру; LC3B — аутофагосомальный ассоциированный с микротрубочками белок 1A/1B-light chain 3 B; НАД — нейроаксональная дистрофия; NF-L — нейрофиламенты; PAS-M.M. — модифицированный реактив Шиффа-Пикро индиго кармин для реакции по Морелу — Маронгеру.


 

Благодарности

Авторы благодарят Пьерангелу Кампананьи за логистическую помощь и Альфио Лаи за техническую помощь. Авторы также хотят поблагодарить двух анонимных рецензентов за их полезные комментарии к тексту.

 

Согласие на публикацию

Владелец собаки дал разрешение на использование животного в исследовании.

 

Этическое одобрение

Протокол, использованный для процедуры эвтаназии собаки, официально разрешён Службой благополучия животных Istituto Zooprofilattico Sperimentale Сардинии (IZSS), согласно её руководству n. I 09 044.

 

 

Литература

1. Chrisman CL, Cork LC, Gamble DA. Neuroaxonal dystrophy of Rottweiler dogs. J Am Vet Med Assoc. 1984;184:464–7.

2. Carmichael KP, Howerth EW, Oliver JE Jr, Klappenbach K. Neuroaxonal dystrophy in a group of related cats. J Vet Diagn Invest. 1993;5:585–90.

3. Evans MG, Mullaney TP, Lowrie CT. Neuroaxonal dystrophy in a Rottweiler pup. J Am Vet Med Assoc. 1988;192:1560–2.

4. Nibe K, Kita C, Morozumi M, Awamura Y, Tamura S, Okuno S, Kobayashi T, Uchida K. Clinicopathological features of canine neuroaxonal dystrophy and cerebellar cortical abiotrophy in Papillon and Papillon-related dogs. J Vet Med Sci. 2007;69:1047–52.

5. Sis S, Hanzlicek D, Fluehmann G, Kathmann I, Tomek A, Papa V, Vandevelde M. Neurodegenerative diseases in domestic animals: a comparative review. Vet J. 2006;171:20–38.

6. Hahn K, Rohdin C, Jagannathan V, Wohlsein P, Baumgärtner W, Seehusen F, Spitzbarth I, Grandon R, Drögemüller C, Jäderlund KH. TECPR2 associated neuroaxonal dystrophy in Spanish water dogs. PLoS One. 2015.

7. Sacre BJ, Cummings JF, De Lahunta A. Neuroaxonal dystrophy in a Jack Russell terrier pup resembling human infantile neuroaxonal dystrophy. Cornell Vet. 1993;83:133–42.

8. Clark RG, Hartley WJ, Burgess GS, Cameron JS, Mitchell G. Suspected inherited cerebellar neuroaxonal dystrophy in collie sheep dogs. N Z Vet J. 1982;30:102–3.

9. Blakemore WF, Palmer AC. Nervous disease in the chihuahua characterised by axonal swellings. Vet Rec. 1985;117:498–9.

10. Diaz VJ, Dunque C, Geisel R. Neuroaxonal dystrophy in dogs: case report in 2 litters of Papillon puppies. J Vet Intern Med. 2007;21:531–4.

11. Kessell AE, Finnie JW, Blumbergs PC, Manavis J, Jerrett IV. Neuroaxonal dystrophy in Australian Merino lambs. J Comp Pathol. 2012;147:62–72.

12. Hamir AN, Miller JM, Stack MJ, Chaplin MJ, Cutlip RC. Neuroaxonal dystrophy in raccoons (Procyon lotor) from Iowa. J Vet Diagn Invest. 2002;14:175–8.

13. Schmidt RE, Dorsey D, Parvin CA, Beaudet LN, Plurad SB, Roth KA. Dystrophic axonal swellings develop as a function of age and diabetes in human dorsal root ganglia. J Neuropathol Exp Neurol. 1997;56:1028–43.

14. Schmidt RE, Coleman BD, Nelson JS. Differential effect of chronic vitamin E deficiency on the development of neuroaxonal dystrophy in rat gracile/cuneate nuclei and prevertebral sympathetic ganglia. Neurosci Lett. 1991;123:102–6.

15. Nibe K, Nakayama H, Uchida K. Immunohistochemical features of dystrophic axons in Papillon dogs with neuroaxonal dystrophy. Vet Pathol. 2009;46:474–83.

16. Cork LC, Troncoso JC, Price DL, Stanley EF, Griffin JW. Canine neuroaxonal dystrophy. J Neuropathol Exp Neurol. 1983;42:286–96.

17. Sis S, Ferrer M, Pumarola M. Juvenile neuroaxonal dystrophy in a Rottweiler accumulation of synaptic proteins in dystrophic axons. Acta Neuropathol. 2001;102:501–4.

18. Fitzpatrick D. Unit II—sensation and sensory processing. In: Purves D, Augustine GJ, Fitzpatrick D, Katz LC, LaMantia AS, McNamara JO, Williams SM, editors. Neuroscience. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates; 2004. p. 189–209.

19. Lee HK, Seo IA, Suh DJ, Hong JI, Yoo YH, Park HT. Interleukin-6 is required for the early induction of glial fibrillary acidic protein in Schwann cells during Wallerian degeneration. J Neurochem. 2009;108:776–86.

 

Источник: Acta Veterinaria Scandinavica (2016) 58:37. This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if changes were made. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated.

 

СВМ № 4/2016

Добавить комментарий

Войти с помощью: 
Close