Уничтожение бактерий в кишечнике мышей стало возможно с помощью плазмид с CRISPR/Cas9

Канадские исследователи опубликовали в журнале Molecular Systems Biology результаты своего эксперимента по созданию плазмиды со встроенным комплексом CRISPR/Cas9, которая за два часа передаётся к 96% целевых бактерий и вызывает их уничтожение в кишечнике мыши. Новая плазмида передаётся в два раза быстрее дикого типа, который использовали ранее.

Поскольку многие энтеробактерии, например Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella sp. и Salmonella sp., опасные сами по себе, могут быстро накапливать гены устойчивости к антибиотикам, учёные ищут альтернативные способы лечения, не включающие противомикробные препараты. Один из таких способов — транспортировка системы CRISPR/Cas9 в целевую клетку для разрезания двухцепочечной ДНК, что приводит к гибели бактерии. Для доставки этой системы используют бактериофаги или клетки других бактерий. Бактериофаги действительно быстро и точно доставляют CRISPR/Cas9, но их селективность снижает быстрая мутация рецепторов фагов на поверхности клеток, а условия окружающей среды в кишечнике (в частности, кислотность и активность ферментов) ухудшают их эффективность. Адаптированные к кишечнику бактерии являются более устойчивыми и используют бактериальную конъюгацию для доставки CRISPR/Cas9 к клеткам-мишеням, но предыдущие эксперименты показывали низкую эффективность передачи плазмиды в кишечнике мышей.

Чтобы решить эту проблему, канадские учёные из Университета Шербрука под руководством Кевина Нила разработали штамм кишечной палочки с более высокой эффективностью бактериальной конъюгации. Он содержит плазмиду TP114 с системой CRISPR/Cas9, нацеленной на ген cat, благодаря которой эффективен при лечении мышей от устойчивых к антибиотикам штаммов E. coli и Citrobacter rodentium. В предыдущем исследовании скрининг большинства использующихся плазмид показал, что TP114 наиболее эффективно передаётся соседним бактериям в микробиоте кишечника.

Для начала исследователи создали три штамма кишечной палочки: KN01, KN02, KN03. Все они устойчивы к стрептомицину, но у каждого есть индивидуальная резистентность к спектиномицину, хлорамфениколу и тетрациклину соответственно. Различия в устойчивости позволяли в процессе экспериментов фенотипировать эти бактерии. KN01 стали транспортёрами плазмиды, KN02 — целевым штаммом, несущим этот ген, а KN03 — нецелевым штаммом (контролем).

Чтобы оценить эффективность конъюгации, все три штамма вводили в кишечник самок мышей (линия C57BL, в каждой группе по шесть особей). Через 36 часов после введения бактерий — доноров плазмиды количество целевого штамма в среднем снижалось на 98,6%, подобные результаты были получены и при введении штамма-донора за 12 часов до целевого. А риботипирование всех микроорганизмов указало, что после обработки штаммом KN01 численность десяти высококонсервативных бактериальных групп не изменилась.

Для создания более эффективных вариантов плазмиды TP114 исследователи использовали ускоренную лабораторную эволюцию, а полученный мутант оказался в два раза эффективнее дикого типа. Эту же плазмиду авторы работы попробовали передать не кишечной палочке, а Citrobacter rodentium. Через два дня количество патогенных бактерий снизилось на 96%.

Таким образом исследователи показали, что конъюгация бактерий — это очень точный способ передачи плазмиды: например, у сконструированной плазмиды скорость конъюгации увеличилась на три порядка по сравнению с диким типом. А высокая эффективность уничтожения целевого штамма в кишечнике мыши (до 96%) указывает, что среда кишечника мало влияет на конъюгацию. Более того, введённые бактерии никак не повлияли на микробиоту кишечника, уничтожая только целевой патоген. Авторы считают, что нацеливание системы на гены резистентности к антибиотикам может быть не лучшим вариантом выбора целевого гена, так как они не всегда находятся в хромосомной ДНК. В будущем учёные предлагают использовать консервативные гены, например, рибосомных белков, для увеличения вероятности гибели целевых клеток.

Источник: nplus1.ru

Оценить материал
Нравится
Нравится Поздравляю Сочувствую Возмутительно Смешно Задумался Нет слов
Теги

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Другие новости

Подписка на новости

После отправки заполненной формы Вам на почту придёт письмо со ссылкой для подтверждения рассылки. Если Вы не видите письма, проверьте папку «Спам». Если не подтвердить рассылку, мы не сможем отправлять её Вам.






Нажимая на кнопку «Подписаться», я даю согласие на обработку персональных данных
Я ознакомлен с политикой конфиденциальности

Close