Улучшение качества лабораторной диагностики пироплазмоза собак (значимость обогащения исследуемого материала с помощью центрифугирования)

4

Ц. Угне, Ц. Брюшо-Угне, Г. Бурдвазу

Центрифугирование образца крови в микрогематокритном капилляре существенно повышает качество диагностики пироплазмоза у собак с помощью цитологического анализа.

Было проведено экспериментальное клиническое исследование, чтобы показать значимость центрифугирования образца крови от собаки, больной пироплазмозом, что позволяет улучшить качество диагностики, осуществляемой с помощью микроскопического исследования эритроцитов, инвазированных паразитами.

1. Животные

Работа была выполнена на четырех группах собак:

– группа А (n = 10) — животные с симптомами анемии, с оценкой гематокрита1 ниже 30%;
– группа В (n = 10) — животные с проявлением одного симптома заболевания – гипертермии, превышающей 39,5°С;
– группа С (n = 20) — животные, инвазированные пироплазмами;
– группа D (n = 20) — клинически здоровые животные, представленные на консультацию для проведения вакцинации.


1 Гематокрит (аббревиатура Ht) (Wintrobe) (гр. haima, кровь; kriktos, разделенный) [англ. Hematocrit]. Это способ определения количества эритроцитов по отношению к объему крови. Для этого используют стеклянную пробирку длиной 11 см, в которой эритроциты методом центрифугирования отделяют от плазмы и затем определяют процентное соотношение объема эритроцитов к объему всего состава крови. Физиологическая норма объема эритроцитов у собаки и кошки в 100 мл крови составляет 37–55 и 24–45 мл, то есть 37–55% и 24–45% соответственно.


В последней группе собак было выявлено три особи, которые шесть месяцев назад были введены в группу С.

Одну собаку из группы А и двух из группы В прошлом году лечили от пироплазмоза.

2. Материалы

Для проведения данного исследования были использованы микрогематокритные трубочки StatSpin R, микроцентрифуга (StatSpin RIII, 15000 об/мин.), полированные и отшлифованные стекла. Окраску, в соответствии с рекомендациями лаборатории, осуществляли после фиксации мазка в метиловом спирте с использованием быстродействующего реактива Hemacolor R.

3. Метод

Забор крови осуществляли из яремной вены или предплечья. Первый мазок выполняли одновременно с определением гематокрита. Для изготовления второго мазка использовали часть седимента (сгустка крови), образовавшегося в стеклянном капилляре после центрифугирования. Чтобы извлечь материал для нанесения его на предметное стекло, стеклянный капилляр обламывали на 2–3 мм ниже границы разделения плазмы и сгустка крови (фото 1). Обеспечив таким образом доступ к интересующей нас части сгустка крови, последний наносили на поверхность стекла с помощью пипетки (фото 2). После фиксации мазки были подвержены окраске с помощью соответствующих реактивов (Hemacolor).

Фото 1. Стеклянный капилляр для проведения микрогематокрита необходимо сломать приблизительно на 2 мм позади от buffy-coat (границы раздела сыворотки крови и ее седимента или сгустка). Фото 2. Тонкий слой изолированных эритроцитов наносят на предметное стекло.

Как в первом, так и во втором мазках крови исследование эритроцитов по периферии осуществляли одним и тем же способом: в 200 полях зрения под микроскопом от начала нанесения мазка до сформированных косичек (×1000 с использованием иммерсионного масла).

Так же вели подсчет эритроцитов, подверженных инвазии паразитами.

4. Результаты исследования

У собак, относящихся к группе А, были выявлены: ятрогенная интоксикация препаратами-антикоагулянтами, действующими на витамин К (n=3); заболевание лейшманиозом (n=3) и эрлихиозом (n=1); вторичная интраперитонеальная геморрагия вследствие гемангиосаркомы селезенки (n=2) и метроррагия (n=1). Животные, относящиеся к группе В, имели следующие заболевания: лейшманиоз (n=4), пиометра (n=3), простатит (n=2) и парвовироз (n=1). Все собаки, вошедшие в группу D для проведения консультации по поводу вакцинации, оказались здоровыми. Средний возраст для групп А, В, С и D соответственно составил: 5,2; 6,4; 4,3 и 4,1 года.

Во время исследования эритроцитов как в первом, так и во втором мазках, полученных от каждой собаки, относящейся к группам — А, В и D, паразитов обнаружить не удалось.

Среди собак группы С, страдающих пироплазмозом (табл. 1), в мазках, с предварительно проведенным центрифугированием, количество эритроцитов, подверженных инвазии пироплазмозом, всегда было больше в сравнении с мазками, изготовленными классическим способом, и в среднем составило 31,6 (со стандартизированным типом отклонения, SD =18,94) и 14,8 (SD = 18,9) соответственно.

Таблица 1. Результаты исследования, полученные от собак, подверженных пироплазмозу (группа С).

Группа С Порода Возраст t тела (°C) Гематокрит (%) Инвазированные эритроциты
в 200 световых полях зрения
(иммерсия, ×1000)
классические
мазки
мазки после
центрифугирования
C1 немецкая легавая 18 мес. 40,2 26 6 > 50
C2 бретонский эпаньол 2 г. 39,6 40 3 11
C3 грифон нивернский 2 г. 39 36 4 > 50
C4 бретонский эпаньол 4 мес. 39,8 30 0 9
C5 бретонский эпаньол 6 лет 40,2 40 1 23
C6 грифон 3 г. 39,2 32 > 50 > 50
C7 *рыжая бретонская 8 мес. 38,7 20 8 50
C8 французский эпаньол 6,5 лет 40,8 32 24 50
C9 помесная 6 мес. 41 30 0 5
C10 бриар 3 г. 40,8 41 2 13
C11 *овчарка 10 лет 39,6 20 13 > 50
C12 колли 4 г. 39,7 43 > 50 > 50
C13 помесная 2 г. 40,3 36 7 17
C14 пудель 13 лет 38,3 18 2 8
C15 *бруно-де-юра 7 мес. 39,7 22 12 37
C16 *овчарка 6 лет 40,6 38 3 18
C17 *босерон 8 лет 39 42 1 5
C18 французский эпаньол 2 г. 39,7 34 > 50 > 50
C19 пудель 4 г. 40,3 23 > 50 > 50
C20 помесная 11 лет 39,9 35 11 36

Различие показателей исследования при использовании метода Стьюдента оказалось статистически достоверным ( р < 0,001).

В четырех клинических случаях, где отмечали выраженную инвазию (>50 эритроцитов на одном из двух мазков, полученных от особей С6, С12, С18 и С19), было установлено, что в классически изготовленном мазке в среднем насчитывали 6,06 инвазированных эритроцитов, тогда как в мазке с предложенной модификацией — 27.

Также, в отдельных случаях (С4, С9) при анализе мазков, полученных классическим способом, не удалось выявить пироплазм, тогда как в мазках, полученных с выше описанной модификацией (после предварительного центрифугирования), удалось выявить минимум пять эритроцитов, инвазированных пироплазмами. После повторного считывания мазков, приготовленных классическим способом (тотальное обследование каждого предметного стекла), было выявлено менее 3 инвазированных эритроцитов.

Данный метод также был апробирован на материале, полученном из ушной вены: качество постановки диагноза было идентично таковому при исследовании крови, взятой из яремной вены.

5. Обсуждение

Пироплазмоз собак — это паразитарное заболевание, которое носит убиквитарный (встречается повсеместно) и плеоморфный характер. Часто наблюдаемыми симптомами являлись: анорексия, апатия, гипертермия, бледность слизистых, иктеричность и изменение цвета мочи. Иногда мы могли наблюдать кровотечение, полиартралгию, неврологические нарушения, кровенаполнение слизистых, а также совокупность симптомов, сопровождающихся острой почечной недостаточностью. Таким образом, данное паразитарное заболевание входит в дифференциальную диагностику большого числа заболеваний собак. Даже если лечение очень эффективное, тем не менее, его применяют с осторожностью, опасаясь возможных осложнений, которые иногда наблюдают. Поэтому для улучшения качества лабораторной диагностики, где например, прибегают к прямому обнаружению паразита с помощью микроскопического исследования, многие авторы предлагают разные методы обогащения исследуемых мазков крови (P. Bourdeu, J.F. Gelfi, 1995; S. Comazzi et coll., 1999).

Установлено, что при исследовании материала эритроциты, пораженные паразитами, чаще выявляют на периферии мазка.

Некоторые предпочитают выполнять мазки из пунктата капилляра ушной раковины, так как считается, что инвазированных эритроцитов на периферии всегда больше, хотя это тоже оспаривается (P. Bourdeu, J.F. Gelfi, 1995).

Достаточно простой способ обогащения исследуемого материала, предложенный J.F. Gelfi, основывается на выдерживании исследуемого образца крови, содержащего антикоагулянт EDTA, в течение нескольких минут в определенных условиях и удалении супернатанта, образовавшегося над сгустком. Для этого исследуемый образец крови подвергают центрифугированию со скоростью 2500 об./мин. в течение 5 минут, и затем образовавшийся седимент (сгусток) наносят на обезжиренное предметное стекло и окрашивают (P. Bourdeu, J.F. Gelfi, 1995).

Недавно итальянская группа исследователей предложила всем набивший оскомину (6 этапов манипуляций с погружением в раствор и разведением) и длительный (приблизительно 50 мин.) метод обогащения, который трудно применим в условиях повседневной практики. Тем не менее, в 17 случаях исследования это позволило получить обогащение мазков с кратностью увеличения показателя до 34, что обеспечило увеличение чувствительности метода до 94% (S. Comazzi et coll., 1999).

Предлагаемый нами метод в целом позволяет клиницисту удовлетворить требования пациента. По простоте исполнения он вполне доступен для помощника врача (фельдшер, санитар), который самостоятельно может выполнить данную процедуру примерно в течение 8 минут. Метод обогащения позволяет увеличить количество инвазированных паразитами эритроцитов на предметном стекле приблизительно в пять раз. Кроме того, во время обследования эритроцитов обнаружение паразита часто облегчается наличием скоплений эритроцитов, подверженных инвазии (фото 3 и 4). Также, один из этапов этого метода исследования позволяет нам определить гематокрит, что является важным критерием для осуществления прогноза заболевания и терапевтического подхода. Лейкоцитарно-тромбоцитарный слой (buffy-coat) также можно подвергнуть исследованию, повышая тем самым точность гематоцитологической диагностики (обнаружение гепатозооноза, относящегося к эрлихиозу и т.д.). Это исследование, выполненное на 20 клинических случаях, указывает на чувствительность метода, близкую к 100%. Таким образом мы добились постановки диагноза приблизительно в 90% случаев заболевания пироплазмозом собак, что позволило исключить назначение пироплазмицидов вслепую. Ограничения по использованию данного метода могут быть связаны как с самим животным (гематокрит ниже 10% не позволяет четко сломать капилляр в необходимом месте), так и считыванием мазка (слабая идентификация паразитов или наличие артефактов).

Фото 3 и 4. Скопление эритроцитов, инвазированных пироплазмами. Быстрая окраска с помощью Hemacolor. Микроскопическое исследование в иммерсионном масле (×1000).

Заключение

Серологический метод исследования не может быть использован в рамках эндемических регионов. Поэтому прямое обнаружение возбудителя пироплазмоза остается основным критерием в постановке окончательного диагноза.

Таким образом, благодаря предлагаемому методу обогащения, клиницист может иметь большую вероятность постановки окончательного диагноза. Предлагаемая модификация вполне доступна для каждого клинициста в его повседневной практике (необходимы только центрифуга и пробирки с материалом), но уровень диагностики при этом повышается.

СВМ 1/2006

Подпишитесь на наш телеграм-канал и получайте важные отраслевые новости в удобном для вас формате.
Оценить материал
Нравится
Нравится Поздравляю Сочувствую Возмутительно Смешно Задумался Нет слов
4
Теги

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Подписка на новости

* - поля, обязательные для заполнения
Нажимая на кнопку, вы даете согласие на обработку своих персональных данных согласно 152-ФЗ. Подробнее
Close