Купирование проявлений кошачьего хламидофилёза при терапии рокситромицином у кошек с непереносимостью доксициклина

K. Ploneczka-Janecziko, J. Bania, K. Blerowiec, M. Klelbowicz, Z. Klelbowicz
Faculty of Veterinary Medicine, Wroclaw University of Environmental and Life Sciences, Wroclaw, Poland

Chlamydophila felis (C. felis) является значимым возбудителем в этиологии конъюнктивита у кошек. У инфицированных кошек часто применяются для лечения антибиотики тетрациклинового ряда (например, доксициклин и окситетрациклин) [4; 22; 8], хотя фторхинолоны также могут быть эффективны [7]. Однако тетрациклиновые препараты (в особенности, доксициклин) могут вызывать у некоторых животных побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта: рвоту, снижение аппетита, диарею, увеличение активности печёночных ферментов и пр. Так, длительное исследование показало, что анорексия, диарея и рвота встречаются у 6–13% кошек, которых лечат соответствующими антибиотиками; увеличение печёночных ферментов наблюдается у 6–18% кошек [19; 20]. Кроме того, German et al. (2005) [6] пишут о риске повреждения структур пищевода после лечения доксициклином, в результате чего лечение должно сопровождаться количественным увеличением дачи воды или корма. Также необходимо избегать тетрациклиновой терапии у беременных кошек и растущих котят [7].

Рокситромицин является полусинтетическим макролидом, производным эритромицина [10], который хорошо проникает в ткани и действует против Rickettsia spp., Chlamydia spp., и Mycoplasma spp. [21]. Рокситромицин показывает хорошую эффективность и безопасность при лечении урогенитальных хламидийных инфекций, также как и окклюзионной болезни периферических артерий, вызванной Chlamydophila pneumonia, у людей [28; 11]. Рокситромицин восстанавливает защитную функцию эпителия респираторного тракта при хроническом воспалительном процессе у кроликов [14]. Также рокситромицин предотвращает появление и рецидивы средних отитов с выпотом у морских свинок [24]. Рокситромицин показывал эффективность при лечении инфекции, вызванной Borrelia burgdorferi у животных в эксперименте [17], отсутствует нейтрализующий эффект печени при применении у крыс [16].

Макролиды обладают противовоспалительным эффектом, что описано при лечении хронических респираторных инфекций у людей [1]. Эритромицин, азитромицин, кларитромицин и рокситромицин могут ингибировать хемотаксис и нейтрофильную инфильтрацию респираторного тракта, снижая таким образом секрецию слизи. Макролиды ингибируют продукцию многих провоспалительных цитокинов (интерлейкинов 1, 6, 8 и фактора некроза опухоли ФНО) in vitro и in vivo. Макролиды также блокируют образование адгезивных молекул, необходимых для миграции нейтрофилов, и усиливают активность мерцательного эпителия респираторного тракта при хронических воспалительных заболеваниях [25; 27].

Эффективность рокситромицина при лечении хламидийной инфекции, а также его противовоспалительные свойства позволили сделать предположение, что этот антибиотик может быть хорошей альтернативой при лечении хламидофилёза у кошек. Таким образом, цель данного исследования: оценить клиническую эффективность орального применения рокситромицина у кошек с непереносимостью тетрациклинов, страдающих хроническими конъюнктивитами, вызванными C. felis.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 14 кошек, принадлежащих частным владельцам, с конъюнктивитом и положительным результатом ПЦР-теста на C. felis, основанном на методике, описанной Marsilio et al. (2004) [13]. Все кошки также обследовались на герпесвирус кошек 1-го типа и Mycoplasma felis методами ОТ-ПЦР и ПЦР согласно опубликованным протоколам [9; 3]. Владельцы дали своё согласие на участие и заполнили опросник. Основным критерием для включения животного в исследование была негативная реакция на доксициклин в первые три дня лечения, включающая рвоту и/или диарею. При сборе анамнеза и клиническом осмотре были исключены другие частые причины таких нарушений: ошибки кормления, инородные тела, заглатываемая шерсть и пр. Характеристика экспериментальной группы дана в таблице 1.

Для оценки клинических симптомов была адаптирована система Hartmann et al. (2008) [7] (таблица 2). Каждому признаку была дана численная оценка и подсчитан общий балл. Клинические признаки оценивались независимо друг от друга, оценку проводил один и тот же человек, максимальный общий балл — 18. Всем кошкам была проведена повторная диагностика методом ОТ-ПЦР с интервалом менее чем 1 неделя с момента прекращения лечения доксициклином для подтверждения поражения C. felis.

Конъюнктивальные парные пробы брались с вентральных сводов конъюнктивы с использованием стерильных ватных тампонов, подготовка к ОТ-ПЦР проходила по методике, описанной Sykes (2005) [26]. Коротко: ДНК с каждого парного тампона извлекалась напрямую с использованием набора QIA Amp Ultra Sens Virus (Qiagen, Syngen Biotech, Wroclaw, Poland). Праймеры, специфичные для гена C. felis ompA (прямой праймер 5′-GAACTGCAAG CAACACCACT G-3′; и обратный праймер 5′;-CCATTCGGCA TCTTGAAGAT G-3′;), были использованы в сочетании с флюорогенным зондом 6-FAM-CGCTGCCGAC AGATCAAATT TTGCC-BHQ. Кошачий ген 28S рДНК использовался как эндогенный конституитивный ген для конъюнктивальных клеток кошек, при этом использовались праймеры согласно Helps et al. (2003) [9], а также зонд CGCGCACCCT ACTGATGATG TGTTGTTGCC GCGCG, с пометкой техасским красным на 5′ конце и присвоением BHQ1 на 3′ конце. Все реакции были поставлены дважды. Каждая реакция ОТ-ПЦР была проведена в 20 мкл смеси, содержащей 10 pM каждого генного праймера ompA, 20 pM каждого 28S генного праймера рДНК, 10 pM FAM/BHQ, и 20 pM техасского красного / пробы BHQ1, 1 мкл эталона, и 10 мкл смеси Kappa Probe FAST qPCR Master mix (Kappa Biosystems, USA). Смесь была подогрета до 95°C на 3 минуты, затем прошла 45 циклов ПЦР по 10 сек при 95°C и 30 сек при 60°C. Флуоресценция была зафиксирована на стадии ренатурации ДНК (iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad Laboratories Ltd., Poland).

В качестве контроля использовалась ДНК C. felis вакцинного штамма 905. Относительное количество ДНК C. felis подсчитывалось с сигнала ДНК C. felis, нормализованного к кошачьему сигналу ДНК, как описано Dean et al. (2005) [4] и Beshir et al. (2010) [2]. Разница между пороговыми циклами Ct (ΔCt) гена ompA C. felis и Ct гена 28S подсчитывалась с использованием метода 2-ΔΔCt [13]. Изменение ΔCt оценивалось после 4-недельного лечения (ΔΔCt), считая с момента взятия диагностических проб до лечения. Для подсчёта относительных уровней C.felis уровень ompA от кошки № 1 был произвольно принят за единицу. Процентное снижение (% KD) подсчитывалось как разница номализованной ΔΔCt и уровней гена ompA на нулевой и 56-й день, умноженная на 100.

Кошки были пролечены с использованием оральной суспензии, содержащей 50 мг рокситромицина (5 мг/кг массы тела), дача препарата осуществлялась каждые 12 часов в течение 4 недель (с нулевого до 28-го дня), после чего следовал четырёхнедельный посттерапевтический период. Конъюнктивальные пробы были собраны на нулевой и 56-й дни. Клинический осмотр с использованием системы оценки проводился в начале исследования (нулевой день) и на четвёртой неделе посттерапевтического периода. Дополнительно изменения в тяжести клинических проявлений оценивались по трёхступенчатой шкале (нарастание, снижение, отсутствие изменений) каждую неделю лечения (7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни).

Для сравнения величин и статистического анализа использовался критерий Уилкоксона для парных выборок (непараметрический аналог Т-критерия Стьюдента для зависимых переменных), выведенный с помощью программы Statistica 10.0.0 (StatSoft).

Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами Этического комитета Вроцлавского университета окружающей среды и естественных наук.

Результаты

Все 14 кошек исследуемой группы были позитивны к ДНК C. felis на нулевой день. FHV-1 был выявлен у одной кошки (№ 10). Mycoplasma spp. обнаружена не была.

У всех кошек, получавших рокситромицин, наблюдалось клиническое улучшение по всем параметрам (таблица 2), до лечения (на нулевой день) клиническая оценка имела общий балл в среднем 6,72 ± 3,24, на 56-й день — 1, 21 ± 1,62 (P < 0,001). При клиническом осмотре отмечено уменьшение истечений из глаз (оценка изменилась с 2,71 на нулевой день до 0,64 на 56-й день, P < 0,001), и признаков конъюнктивита (с 2,78 на нулевой день до 0,42 на 56-й день, P < 0,001). Исчезновение симптомов конъюнктивита произошло у девяти кошек (64%) к 7-му дню применения рокситромицина, у всех кошек — к 14-му дню. Кроме этого, у кошек, принимавших рокситромицин, наблюдалось улучшение также в отношении тяжести носовых истечений (P — 0,028) и характера дыхания (P — 0,043). Сравнительная статистика для лёгочных шумов и чихания не делалась ввиду маленькой изменчивости. Со слов владельцев, в период лечения рокситромицином не отмечалось эпизодов рвоты или диареи, которые могли бы быть расценены как побочные эффекты. На 56-й день у девяти кошек (64,2%) отмечалось уменьшения количества сигналов ДНК C. felis по сравнению с таковым до начала лечения (в 1,006–17,1 раз меньше, чем первоначальное значение), но у других пяти кошек (35,7%) отмечено увеличение положительных сигналов (в 1,2–128,5 раз выше, чем первоначальное значение) (рис. 1).

Обсуждение

Постановка диагноза и лечение заболеваний, вызванных бактериями семейства Chlamydiaceae, затруднены ввиду недостатка стандартных процедур для проведения культуральных исследований возбудителя, низкого уровня излечения для клинических изолятов и потенциальной гетеротипичной резистентности к антимикробным препаратам. Антибиотикотерапия против Chlamydia/Chlamydophila может быть неэффективной, что приводит к хроническому инфекционному процессу или нарушению цикла воспроизводства хламидий [18]. На эффективность лечения могут также влиять такие факторы, как нарушение режима дачи антибиотика владельцем, контакт с другими кошками, что потенциально может привести к перекрёстной контаминации Chlamydophila, а также различные воздействия на иммунную систему у кошек со свободным выгулом.

Препараты, которые могли бы стать альтернативой доксициклину для лечения Chlamydophila, широко исследовались. Sturgess et al. (2001) [23] описали эффективность 19-дневного лечения амоксициллином и клавулоновой кислотой кошек, у которых изначально отсутствовали специфичные патогены, и которые были экспериментально заражены изолятами C.felis. Вначале в результате лечения уровень изолята уменьшился, и клиническое состояние улучшилось, но у 62% кошек произошёл рецидив в течение 40 дней, что потребовало увеличить продолжительность терапии на 4 недели для избавления от инфекции. Энрофлоксацин (5 мг/кг, 14 дней) улучшил клиническое состояние при конъюнктивите, но исследование методом иммунофлуоресцирующих антител конъюнктивальных смывов показало, что некоторые кошки по-прежнему оставались позитивными к Chlamydia/Chlamydophila spp., несмотря на то, что уровень энрофлоксацина в слезе превышал минимальный, необходимый для ингибирования данного возбудителя [5]. Owen et al. (2003) [15] описали эффективность азитромицина для лечения кошачьего хламидиоза, вызванного Chlamydophila. Азитромицин (10–15 мг/кг ежедневно в течение 3 дней и затем дважды в неделю, общая продолжительность лечения — 20 дней) также устранял клинические симптомы, но C. felis повторно выявлялись у большинства исследуемых животных. Изначально лечение доксициклином при ежедневной даче препарата в количестве 10 мг/кг в течение двух недель было стандартом для лечения инфекции C. felis. Однако даже 3-недельное лечение в ряде случаев может оказаться недостаточным для полного уничтожения возбудителя, и ДНК C. felis продолжала обнаруживаться у некоторых животных через 35 дней после лечения [4]. Поэтому мы выбрали схему исследования, при которой лечение рокситромицином проводилось в течение
4 недель, а затем следовал 4-недельный посттерапевтический период.

Насколько нам известно, это первое клиническое исследование, в котором рокситромицин использовался для лечения хламидофилёза у кошек с непереносимостью доксициклина. Мы использовали стандартизированную клиническую оценку по Hartmann et al. (2008) [7] для того, чтобы сделать сравнение в процессе исследования. У Hartmann с соавторами результат на нулевой день варьировался от 4,5 до 4,9, что меньше, чем в нашем исследовании, и говорит о том, что в их работе изначальное клиническое состояние кошек было лучше. Тем не менее, оба исследования показывали сходные результаты конечного улучшения состояния. У Hartmann et al. в результате применения прадофлоксацина клинические признаки конъюнктивита исчезали в первую неделю медикаментозного лечения, и так же, как и мы, авторы наблюдали положительный эффект со стороны конъюнктивы и респираторного тракта. Таким образом, четырёхнедельное оральное применение рокситромицина подходит для устранения клинических проявлений хламидийного конъюнктивита у кошек.

Контролируемое исследование двойным слепым методом, проведённое Hartmann et al. (2008) [7], включало кошек, получавших прадофлоксацин (5 мг/кг ежедневно в течение 42 дней), доксициклин (5 мг/кг каждые 12 ч) или плацебо. Мы измеряли уровень ДНК C. felis, используя те же ompA ОТ-ПЦР праймеры [4] и такие же методы подсчёта. В исследовании Hartmann с соавторами из 23 кошек, позитивных к C. felis на нулевой день исследования, 17% выделяли ДНК возбудителя в конце лечения. Некоторые кошки оставались позитивными к C. felis на 42-й день, несмотря на то, что результат анализа ОТ-ПЦР во время исследования был негативным. В нашем случае 35,7% кошек, пролеченных рокситромицином, оставались позитивными к C. felis на 56-й день. Dean et al. (2005) [4] сделали вывод, что 21-дневная терапия доксициклином излечивает 53% кошек, изначально свободных от возбудителя и инфицированных C. felis (3×103 инфекционных единиц в полевых изолятах). Однако различия в путях заражения (инокуляция на конъюнктиву свободных от возбудителя кошек и естественное инфицирование) и протяжённости лечения делают сравнение этих исследований затруднительным. В ряде случаев для излечения требовалась и более длительная (28 дней) терапия [7]. У кошек, инфицированных естественным путём и пролеченных доксициклином, в начальном периоде наблюдения также может не выявляться присутствие C. felis. Вариабельность изначального числа микроорганизмов и ответа на терапию у разных животных является главным ограничением для исследования. Длительный период заболевания (6–12 и более месяцев) могли быть причиной того, что у 5 кошек, результат диагностики которых в конце лечения был позитивным, не произошло полного избавления от Chlamydophila. Три кошки, которые показывали увеличение содержания в организме C. felis после рокситромициновой терапии, имели слизисто-гнойные выделения во время лечения, что говорит о контаминации бактериальной инфекцией. Вариабельность в эпизоотических различиях, в частности, разной степени риска повторного инфицирования у животных с выгулом и без, также затрудняют интерпретацию. Три кошки, у которых отсутствовало снижение уровня C. felis, имели в доме контакт с другими кошками, при этом инфекционный статус этих других кошек неизвестен. Одна кошка постоянно жила на улице, что могло привести к передаче C. felis от других животных. Можно сделать вывод, что ограниченные возможности в изоляции кошек от факторов внешней среды или невозможность изменить привычки хозяев затрудняют исключение влияния этих факторов на уровень инфицирования и реинфицирования. Существуют несколько возможных причин увеличения числа C. felis у нескольких особей при общем улучшении клинического состояния у всех кошек. Наиболее существенными, по нашему мнению, являются вторичные бактериальные патогены, вовлечённые в процесс течения конъюнктивита, и чувствительные к рокситромицину, и/или возможность повторного заражения C. felis. Влияние подобной реинфекции при конъюнктивите (возникшего естественным путём) недостаточно изучено и требует более детального исследования. Так или иначе, доказательства размножения возбудителя и количественный анализ уровня C. felis в подобных случаях отсутствуют.

На результаты лечения рокситромицином также могла повлиять первоначальная доксициклиновая терапия. Нарушение нормального цикла размножения хламидий в результате кратковременного применения антибиотиков может приводить к возникновению устойчивости и последующей хронической инфекции. Антибиотикотерапия приводит к образованию аберрантных ретикулярных тел, которые продолжают синтезировать белки и реплицировать ДНК, но деление клеток прекращается [18]. Доксициклиновая терапия была прервана в результате негативных побочных эффектов у животных, но такое прерывание может приводить к возникновению устойчивости хламидий in vitro и затруднять излечение in vivo [18]. Так или иначе, слишком короткая продолжительность лечения доксициклином не позволяет с уверенностью оценить его влияние на возникновение устойчивости инфекции. Wyrick и Knight (2004) [29] сообщали о появлении резистентных к азитромицину штаммов хламидий под воздействием пенициллина.

В заключение мы можем сказать о видимом клиническом улучшении у кошек, инфицированных C. felis, после 4-недельной терапии рокситромицином. Тем не менее, лечение рокситромицином не гарантирует избавление животных от C. felis, в особенности, если не устраняются определённые эпизоотические факторы. Требуется дальнейшее изучение кошек в контролируемых группах для полноценного определения потенциала рокситромицина для лечения конъюнктивитов, вызванных C. felis.

Источник: Veterinarni Medicina, 60, 2015 (11). This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/ licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

СВМ № 3/2016