Микробиологический профиль и профиль антибиотикорезистентности при наружном отите у собак. Сравнительный анализ

V. Petrov¹, G. Zhelev¹, P. Marutsov¹, K. Koev¹, S. Georgieva², I. Toneva² & V. Urumova^1
1Department of Veterinary Microbiology, Infectious and Parasitic Diseases
²Student; Faculty of Veterinary Medicine, Trakia University, Stara Zagora, Bulgaria

Резюме

Целью настоящего исследования было сравнение распространённости микробных агентов, принимающих участие в этиологии наружного отита у собак, и их чувствительности к антимикробным препаратам в двух периодах: 2007–2011 и 2013–2017 годы. В период 2013–2017 годов доминирующими видами бактерий были коагулазоположительные стафилококки (186 изолятов), на втором месте — Pseudomonas aeruginosa (82 штамма). Уровень изолированных грибов (в основном, Malassezia pachydermatis) был сравнительно высок (152 изолята). По сравнению с более ранним периодом (2007–2011) была отмечена тенденция к более частому возникновению коинфекций (61,7%), и более чем в 80% случаях коинфекции выделялись дрожжевые организмы. Картина антибиотикорезистентности показывала явный тренд к усилению резистентности коагулазоположительных стафилококков и β-гемолитических стрептококков к амоксициллину/клавулановой кислоте (42 и 50% соответственно) и гентамицину (29 и 40%). Было отмечено увеличение резистентности P. aeruginosa к гентамицину (16%) и амикацину (18%). Доля псевдомонад, устойчивых к энрофлоксацину, была более низкой (27%).

Ключевые слова: антибиотикорезистентность, собака, микробиологический профиль, наружный отит.

Вступление

Наружный отит (otitis externa) — острое или хроническое воспаление ушной раковины, наружного слухового прохода и наружного слоя барабанной перепонки [35]. Заболевание может быть как первичным (инородные тела, эктопаразиты и т. п.), так и вторичным вследствие осложнений стеноза слухового прохода, при висячих ушах, попадании чрезмерного количества шерсти или воды в слуховой проход, обструкции, атопическом дерматите, аллергических кожных реакциях на корм, метаболических расстройствах, абнормальной кератинизации, аутоиммунных процессах, повреждениях при манипуляциях и т. д. Наружный отит широко распространён среди щенков, поражая 5–20% животных [2; 12; 20; 37].

Нормальная микрофлора ушного канала включает, главным образом, Staphylococcus spp. (коагулазопозитивных и коагулазоотрицательных), β-гемолитических Streptococcus spp., Bacillus spp. [37; 20]. Также сообщалось о присутствии в наружном ухе Malassezia pachydermatis (M. pachydermatis), Microsporum canis и Otodectes cynoti без возникновения воспаления [6; 14; 1; 21].

Наиболее частыми патогенами, связанными с возникновением наружного отита, являются представители рода Staphylococcus, Streptococcus spp., Corynebacterium spp.; Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Proteus mirabilis (P. mirabilis), Escherichia coli (E. coli) и Klebsiella pneumoniae [17]. Основными видами стафилококков, участвующих в этиологии заболевания, являются коагулазоположительные S. pseudintermedius (ранее S. intermedius) [10], S. aureus, S. schleiferi subs. coagulans и коагулазоотрицательные S. epidermidis, S. schleiferi subs. schleiferi, S. simulans и S. saprophyticus [19; 15; 27; 23]. M. pachydermatis также обнаруживается во многих случаях. Дрожжевые организмы широко распространены у животных, длительно лечившихся антибиотиками. Следует отметить, что бактерии и грибы не выступают в качестве первичных патогенов при наружном отите, но являются случайными видами, которые размножаются при благоприятных условиях вследствие возникновения иных первичных причин [32; 25].

Лечение наружного отита у собак по-прежнему остаётся серьёзной проблемой. В клиниках для мелких животных обычно применяется местная антимикробная терапия с целю уничтожения бактериальной или грибковой инфекции [2]. Однако для успеха терапии важно определение первичной причины воспаления уха [18]. В большинстве случаев антибактериальная терапия назначается без идентификации микробных патогенов и их чувствительности к антимикробным препаратам. Такой подход часто неэффективен, когда микроорганизмы устойчивы к применяемым препаратам; это ведёт к рецидивам отита, поскольку первичная причина не устраняется или же вследствие селекции устойчивых штаммов.

Цель настоящего исследования — изучить изменения в распространённости инфекционных агентов при наружном отите у собак и их чувствительности к антимикробным препаратам в 2013–2017 годах по сравнению с периодом 2007–2011 годов [30].

Материалы и методы

Исследование проводилось в период между январём 2013 и декабрём 2017 года в микробиологической лаборатории кафедры ветеринарной микробиологии, инфекционных и паразитарных болезней факультета ветеринарной медицины Фракийского университета, Стара-Загора, Болгария.

Животные и пробы

Всего были взяты пробы у 185 собак с наружным отитом. 124 собаки имели двухсторонний отит, всего у них были взяты 248 проб (из каждого уха). Число проб от собак с односторонним отитом составило 61. Все 309 мазка с секретом, выделяющимся при наружном отите, были присланы из частных ветеринарных клиник для бактериологического исследования и тестов на антибактериальную чувствительность. Они помещались в систему Amies transport medium при низких температурах и транспортировались в лабораторию логистическими компаниями.

История болезни в большинстве случаев включала хроническое течение, эмпирическое лечение без удовлетворительного результата и частые рецидивы.

Микробиологическое исследование

Образцы культивировались одновременно на кровяном агаре (Merck, Германия) с содержанием 5% крови овец и на агаре МакКонки (Merck, Германия). Культуры инкубировались аэробно 24–48 часов при температуре 37°C. Для микробиологического исследования те же образцы высеивались на 2–7 дней на 4% декстрозный агар Sabouraud (Merck, Германия) с добавлением 0,4 г/л хлорамфеникола (> 99% HPLC, Fluka, Китай) и 0,5 г/л актидиона (циклогексимид, > 93% HPLC, Fluka, Китай) при 37°C аэробно. Изоляты стафилококков идентифицировались согласно руководствам Bergey’s Manual of Determi-native Bacteriology [16] и Manual of Clinical Microbiology [26] на основе внешнего вида колоний, окрашивания по Граму, выделению пигментов, наличию гемолизиса и биохимическим свойствам (продукция каталазы, оксидазы и коагулазы).

Чувствительность бактериальных изолятов к антимикробным препаратам тестировалась методом диффузии дисков, интерпретация результатов — согласно системе оценки Бауэра-Кирби [5], в соответствии с указаниями Института клинических и лабораторных стандартов (2013). Были использованы следующие диски с антимикробными веществами: амоксициллин/клавулановая кислота (20/10 мкг), цефкином (30 мкг), гентамицин (10 мкг), тобрамицин (10 мкг), амикацин (30 p.g), энрофлоксацин (5 мкг), марбофлоксацин (5 мкг), хлорамфеникол (30 мкг), линкомицин/спектиномицин (9/100 мкг) и полимиксин B (10 мкг).

Статистический анализ

Проведено определение 95-процентного доверительного интервала с помощью статистического программного обеспечения GraphPad InStat v. 3.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA).

Результаты

Отрицательные результаты микробиологического исследования были получены для 35 из 309 проб. Из 274 образцов с ростом микроорганизмов были изолированы 505 штаммов (таблица 1).

Таблица 1. Число и соотношение изолятов патогенов при наружном отите собак в период 2013–2017 годов

Моноинфекция была диагностирована в 105 (38,3%) из 274 позитивных образцов. Чаще всего в изолятах были выявлены коагулазоположительные Staphylococcus и P. aeruginosa (39 и 31 случай, соответственно), следующая по частоте — M. pachydermatis (23 случая). Моноинфекции, вызванные коагулазоотрицательными стафилококками, P. mirabilis, Corynebacterium spp. и β-гемолитическими стрептококками, встречались редко (в 5, 3, 3, 1 случае соответственно). Чаще всего встречалась коинфекция (169 случаев, или 61,7%), с преобладанием комбинации коагулазоположительных стафилококков и M. pachydermatis (67 случаев); коагулазоположительных стафилококков и P. aeruginosa (11 случаев); M. pachydermatis и P. aeruginosa (10 случаев). В 44 образцах были выделены одновременно три вида микроорганизмов, также с преобладанием ассоциации коагулазоположительных стафилококков, M. pachydermatis и P. aeruginosa (15 случаев) и коагулазоположительных стафилококков, M. pachydermatis и β-гемолитических Streptococcus spp. (10 случаев). Из остальных 10 образцов выделены одновременно 4 вида микроорганизмов.

У 104 собак выделенные микроорганизмы были одинаковыми для левого и правого уха; таким образом, анализировались 334 изолята, включая 92 штамма грибов. Протестирована чувствительность к антимикробным препаратам 242 бактериальных изолятов (таблицы 2 и 3).

Антибиотикорезистентность обнаруживалась во многих случаях. Коагулазопозитивные стафилококки показали высокую резистентность к амоксициллину с β-лактамазным ингибитором. Эти бактерии также часто были устойчивыми к линкомицину/спектиномицину, полимиксину B, хлорамфениколу и фторхинолонам. Стафилококки, выделенные у собак с наружным отитом, были наиболее чувствительны к аминогликозидам и цефкиному.

Как и ожидалось, наибольшую устойчивость к антимикробным препаратам демонстрировали псевдомонады, в особенности против амоксициллина/клавулановой кислоты, линкомицина/спектиномицина и хлорамфеникола. Изоляты P. aeruginosa имели относительно хорошо сохранённую чувствительность к гентамицину и амикацину, однако были значительно резистентны к энрофлоксацину и марбофлоксацину.

Обсуждение

Сравнение данных за 2013–2017 годы с аналогичными за предыдущий период 2007–2011 годов [30] показало, что стафилококки, M. pachydermatis и P. aeruginosa являлись преобладающими видами микроорганизмов, изолированных от собак с наружным отитом. В 2013–2017 годах коагулазоположительные стафилококки встречались больше чем в 70% клинических случаев. Заметный рост доли образцов с изолятами грибов (M. pachydermatis и Candida spp.) — более 65% и P. aeruginosa — 33% был отмечен в сравнении с предыдущим периодом, процентное отношение случаев 40 и 17% соответственно. Это увеличение, вероятно, является следствием большего числа клинических образцов от пациентов с хроническим отитом, безуспешным лечением или рецидивами в истории болезни. Подобное высокое преобладание M. pachydermatis у собак было отмечено Crespo et al. (2002) в Испании, Nardoni et al. (2014) в Италии и Bardshiri et al. (2014) в Иране. Schick et al. (2007) изолировали P. aeruginosa в 53% случаев хронического наружного отита у собак, как и в нашем исследовании.

Наличие моноинфекции M. pachydermatis в 23 случаях служит доказательством неудачи антибиотикотерапии, назначаемой без идентификации присутствующих микробных агентов. Это комменсальные виды, обитающие на коже животных и человека, размножающиеся при наличии благоприятных факторов, таких как стеноз слухового прохода, массовое наличие шерсти, повышенная влажность и длительное лечение антибиотиками [28]. Между тем, по сравнению с нашим предыдущим исследованием [30], снизилось число проб, из которых были выделены только грибы. Вероятно, это может быть связно с бо́льшим числом пациентов с хроническим отитом с полимикробной ассоциацией. В настоящем исследовании коинфекции с участием грибов присутствовали почти в 80% случаев (140 из 169 образцов с выделением более одного изолята) по сравнению с 50% (66 образцов из 132 коинфекций) в предыдущем исследовании.

Анализ тестов на чувствительность бактериальных изолятов показывал высокую устойчивость грамположительных бактерий к классическим антимикробным препаратам: β-лактамам и линкоспектину. Особое внимание необходимо уделить значимому увеличению устойчивости грамположительных бактерий к комбинации амоксициллина/клавулановой кислоты. Наши данные по чувствительности к этим препаратам сравнимы с результатами, полученными De Martino et al. (2016) и Saputra et al. (2017), но существенно выше, чем уровни, выявленные Robaj et al. (2015); Metiner et al. (2015); Dziva et al. (2015) и Terziev & Urumova (2018). Установленное повышение устойчивости изолятов стафилококков к аминогликозидам, хотя и не столь выраженное, в несколько раз превышало показатели других исследований. Например, Dziva et al. (2015) сообщали о 17% устойчивости к гентамицину, De Martino et al. (2016) — 11%, а Metiner et al. (2015) — только 2,5%. Только 1,1% штаммов стафилококков, изолированных от собак, были нечувствительными к амикацину в исследовании Saputra et al. (2016). Сходные с нашими данные об уровне резистентности были опубликованы Robaj et al. (2015): более 30%.

Сравнение устойчивости бактериальных изолятов при наружном отите собак в настоящем и предыдущем [30] исследованиях показало, что резистентность грамположительных бактерий (коагулазоположительные стафилококки и β-гемолитические стрептококки) к амоксициллину/клавулановой кислоте выросла в 8–10 раз: с 5 до 42 и 50%. Уровень устойчивости к остальным исследуемым антибиотикам изменился в меньшей степени, тогда как чувствительность коагулазоположительных стафилококков к полимиксину B даже увеличилась с 34 до 52%. Схожая тенденция — снижение устойчивых изолятов с 59% до 50% — наблюдалась в отношении комбинации линкомицин/спектиномицин (таблица 4).

Таблица 4. Антибиотикорезистентность (%) изолятов грамположительных бактериальных агентов при наружном отите собак в периоды 2007–2011 и 2013–2017 годов

Н.О. – не определялось.

Установленная повышенная устойчивость стрептококков почти ко всем оцениваемым антибиотикам, в особенности амоксициллину/клавулановой кислоте, гентамицину, хлорамфениколу, соответствует результатам, полученным De Martino et al. (2016). Нужно отметить, что стрептококки являются редкими изолятами у собак с отитом. Их появление в большей степени при коинфекциях, нежели при моноинфекциях, наводит на мысль неуспешного применения антибиотиков, проводимого без чёткого определения патогенов и их антимикробного профиля.

Что касается грамотрицательных бактерий, более детальный анализ можно было сделать в отношении изолятов P. aeruginosa, поскольку число штаммов E. coli и P. Mirabilis было низким. Как и ожидалось, процент псевдомонад, устойчивых к хлорамфениколу, амоксициллину/клавулановой кислоте и линкомицину/спектиномицину, был очень высоким. Выявленный уровень устойчивости среди изолятов Pseudomonas в настоящем исследовании был выше, чем в работах других исследователей [31; 9], но сходен с выявленным Sutkeviciute (2015) в Латвии.

Явная тенденция к увеличению резистентности штаммов Pseudomonas к обычным антимикробным препаратам, используемым в клинической практике — аминогликозидам, в первую очередь — гентамицину (таблица 5), является одной из существенных проблем для практикующих ветврачей. В то же время налицо значимое снижение доли штаммов, устойчивых к другой используемой группе антибиотиков — фторхинолонам, в особенности энрофлоксацину. Наблюдавшаяся примерно у одной трети изолятов P. aeruginosa устойчивость к энрофлоксацину и марбофлоксацину может быть следствием неверного подхода к терапии отита собак, вызванного Pseudomonas, что привело к возникновению резистентных штаммов. Данная ситуация, вероятно, схожа с таковой в других странах, как видно из сообщений о низкой чувствительности псевдомонад к энрофлоксацину: 52% [22], 56,5% [9], только 35% [36].

Таблица 5. Антибиотикорезистентность (%) изолятов грамотрицательных бактериальных агентов при наружном отите собак в периоды 2007–2011 и 2013–2017 годов

* from Petrov et al. (2013)
Н.О. – не определялось.

Подобная тенденция была выявлена в отношении резистентности штаммов P. mirabilis. Эти микроорганизмы были отмечены как имеющие наибольшую устойчивость к хлорамфениколу, линкомицину/стрептомицину и амоксициллину/клавулановой кислоте. Изоляты Proteus выделялись при хронических коинфекциях, в основном ассоциированных с P. aeruginosa и M. pachydermatis. Таким образом, устойчивость к этим антимикробным препаратам не имела существенного влияния на эффективность терапии, поскольку псевдомонады также были к ним устойчивы. Резистентность почти 1/3 штаммов P. mirabilis к гентамицину и амикацину, частичная ассоциация с псевдомонадами, для которых эти антибиотики являются стратегическими, подтверждают предположение о неверном подходе к лечению хронического отита у собак.

Среди изолятов E. coli устойчивость к гентамицину и энрофлоксацину выросла почти в два раза. Этот факт говорит о том, что назначение этих антибактериальных препаратов без необходимости до сих пор является распространённой практикой, тогда как колибактерии очень легко вырабатывают резистентность. Это не является только внутринациональной проблемой. Исследование, проведённое в Австралии, показало, что 40% ветврачей используют фторхинолоны при лечении наружного отита у собак эмпирически, и когда при цитологии обнаруживаются грамотрицательные палочки, их доля достигает 61% [13]. Это приводит к быстрой выработке антибиотикорезистентности бактериальных штаммов, особенно после продолжительного лечения [29].

Сходные результаты были получены в отношении уровня резистентности к хлорамфениколу и линкомицину/спектромицину — в нашем предыдущем исследовании все изоляты E. coli были чувствительны к ним, тогда как в настоящем исследовании 30–40% изолятов уже приобрели устойчивость.

Всё ещё сохранившаяся 100-процентная чувствительность изолятов E. coli к амикацину, тобрамицину и полимиксину B требует внимательного использования этих стратегических антимикробных препаратов в будущем.

Заключение

Сравнительный анализ соотношения изолятов при отите собак показывает увеличение встречаемости комменсальных видов M. pachydermatis и P. aeruginosa, наряду с повышенной устойчивостью бактерий к наиболее используемым антибактериальным препаратам. Таким образом, необходимо использование точной этиологической диагностики и тестов на чувствительность к медикаментозной терапии. Такой подход позволит проводить научно обоснованную целенаправленную антибактериальную терапию.

Источник: Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 2019, 22, No 4, 447-456, DOI: 10.15547/bjvm.2151. The BJVM operates under Creative Commons License BY-NC-ND 4.0.

СВМ № 1/2021