Две группы учёных практически одновременно представили описание опытов по внесению изменений в гены взрослых макак, в результате которых удалось снизить уровень холестерина в крови животных. Редактор нуклеотидных оснований на основе метода CRISPR/Cas позволил внести однонуклеотидные мутации и «сломать» один из генов, а доставка конструкции при помощи липонаночастиц помогла направить действие механизма в один орган — печень. Одна из описываемых работ опубликована в Nature Biotechnology, другая размещена в Nature.
Редактирование генов живых существ — недавно появившийся терапевтический подход, с помощью которого учёные надеются вносить изменения в ДНК пациентов. Исследователи используют как нуклеазы (ферменты, которые разрывают связь между соседними нуклеиновыми кислотами) CRISPR-Cas9 и -Cas12, так и CRISPR-редакторы нуклеотидных оснований — аденина и цитозина. Редакторы обладают одним ярким преимуществом перед нуклеазами: чтобы внести мутацию, им нет необходимости разрушать связи между соседними нуклеотидами и нарушать целостность двух цепочек ДНК. Однобуквенная замена пары аденин-тимин на гуанин-цитозин происходит под действием фермента деаминазы. Этот фермент заменяет в одной цепи ДНК аденин на инозин, который воспринимается полимеразами как гуанин. Затем система вносит одноцепочечный разрыв во вторую цепь, и система репарации подставляет аденин.
Внесение всего одной замены очень интересует биологов: большинство патогенных природных мутаций как раз состоит из замены пары Г-Ц на А-Т. Кроме того, даже одна замена может помочь отключить ген, который работает слишком активно — например, ген PCSK9, который экспрессируется в основном в печени и служит регулятором экспрессии рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-рецепторов). Известно, что мутации, повышающие эффективность PCSK9 у людей, приводят к повышенному содержанию холестерина в крови. И наоборот, у 2–3% людей появляются мутации, которые нарушают функции PCSK9, и тогда в крови понижается уровень липопротеинов низкой плотности, что не вредит здоровью, но снижает риск атеросклероза. Теоретически внесение одной мутации в этот ген может помочь пациентам долгосрочно (и даже, возможно, навсегда) снизить уровень холестерина в крови.
Сразу две группы учёных независимо описали результаты, полученные в ходе экспериментов над приматами из семейства мартышковых: при помощи CRISPR-редакторов адениновых оснований исследователи из Цюрихского университета под руководством Геральда Шванка (Gerald Schwank) и компании Verve Therapeutics под руководством Секара Катхиресана (Sekar Kathiresan) внесли однонуклеотидные мутации в ген PCSK9 у макак-крабоедов.
Обе группы определили такие регионы в PCSK9, мутация в которых приводит к нарушению сплайсинга (созревания) соответствующей мРНК. То, что мутация действительно снижает экспрессию гена, учёные сначала проверили на клеточных культурах человеческих гепатоцитов и мышиных моделях.
Исследователи из Verve Therapeutics использовали липонаночастицы, чтобы доставить мРНК аденинового редактора в клетки печени макак. После введения частиц у макак повышался уровень маркеров повреждения печени в крови, но через две недели приходил в норму. Спустя две недели эффективность редактирования составила 53%, при этом уровень белка PCSK9 в крови снизился на 65%. Адениновая замена прошла в основном в печени. Эффект был менее заметен в селезёнке и почти не заметен в других органах. Учёные отметили, что один миллиграмм частиц на килограмм веса животного — доза, при которой достигается максимальная эффективность редактирования и минимальный уровень PCSK9 в крови.
Учёные из этой группы также начали долгосрочное исследование, чтобы проверить переносимость животными такой терапии. К моменту написания статьи у макак наблюдали сниженный уровень PCSK9 в крови на протяжении восьми месяцев, холестерин снизился на 60%, и при этом отсутствовали признаки отрицательного влияния на здоровье животных.
Группа исследователей из Цюрихского университета провела подобные эксперименты. Учёные протестировали не только разные дозировки средства, но и разные режимы введения: часть животных получала два введения с разницей в две недели. Отредактировать удалось 27,6±5,87% целевых нуклеотидов, и добавочная доза не повысила эффективность. Точностью метода авторы остались довольны: 88% всех изменений, вызванных CRISPR-редактором. При этом учёные из этой группы заявляют о куда меньшем снижении уровня холестерина в крови (по сравнению с результатами коллег): на 9–19%.
Авторы второй работы также проверили, реагирует ли иммунитет животных на чужеродный белок. В отличие от мышей, повторное введение средства приматам не повысило эффективность редактирования, и учёные посчитали, что их организм блокирует действие редактора. Антитела, специфичные к белкам-редакторам, действительно нашлись у получивших терапию макак. Исследователи предполагают, что если в следующий раз повторную дозу ввести до того, как сформируется иммунитет к белкам, то эффективность терапии повысится.
В целом обе группы отметили небольшую нецелевую активность системы, а также отсутствие значимых побочных эффектов. Учёные надеются, что когда-нибудь подобная тактика снижения холестерина в крови станет альтернативой существующим методам. Кроме того, доставка липонаночастицами конструкций с белками для замены нуклеотидов может помочь и с другими генетическими заболеваниями, единственное решение для которых сейчас — трансплантация печени.
Источник: nplus1.ru
