Определение суммарной антиоксидантной способности у собак при расширении и завороте желудка

Цель данного исследования — определить суммарную антиоксидантную способность у собак при синдроме расширения и заворота желудка (РЗЖ) и установить её корреляцию с концентрацией высокомобильного группового белка box 1 (HMGB1) и лактата. Проанализирована также корреляция между этими параметрами и тяжестью заболевания. Работа выполнена на 20 животных: 14 собак с РЗЖ и 6 — контрольная группа. Кровь брали при поступлении в клинику и в начале реперфузии. Антиоксидантную способность определяли при помощи параметра TRAP. Данный параметр достоверно не отличался от контроля у больных животных при поступлении в клинику. При реперфузии значение TRAP уменьшилось у шести и увеличилось у восьми собак; установлена сильная корреляция между параметром TRAP и концентрацией HMGB1 (r=0,83, р<0,01). Тяжесть заболевания коррелировала с уровнями HMGB1 и лактата, а также с параметром TRAP.

Введение

Синдром расширения и заворота желудка (РЗЖ) является острым и опасным для жизни заболеванием, к которому предрасположены собаки крупных пород с глубокой грудной клеткой. Определяющим в развитии болезни является поворот привратника справа налево в краниальном направлении, при этом спонтанное восстановление нормального положения желудка невозможно из-за скопления газов. Неясно, является ли оно первичным или вторичным относительно заворота желудка [7]. Изменение положения и расширение желудка ведут к ухудшению перфузии его стенки и проксимального отдела двенадцатиперстной кишки. Для успешного лечения необходимо хирургическое вмешательство с целью декомпрессии и вправления желудка. С точки зрения патогенеза и терапии, РЗЖ можно рассматривать как in vivo модель ишемии-реперфузии.

Реперфузия, следующая за периодом ишемии, связана с образованием активных форм кислорода (АФК), включая его свободные радикалы, перекись водорода, продукты перекисного окисления липидов и другие молекулы, вызывающие повреждение тканей [6]. В желудочно-кишечном тракте АФК продуцируются как в полости, так и в слизистой. Основным источником радикалов в кишечнике, вероятно, является ксантиноксидаза. Активированные нейтрофилы также генерируют кислородные радикалы с образованием перекиси водорода и гипохлоритных ионов [9]. Влияние АФК на ткани обратно пропорционально их способности к антиоксидантной защите. Антиоксидантная система включает в себя следующие компоненты: эндогенные антиоксиданты, такие как гидрофобные молекулы (α-токоферол и β-каротин), водорастворимые антиоксиданты (аскорбиновая кислота и билирубин) и ферменты (каталаза и глутатионпероксидаза) [6]. Хотя существуют различные методы определения антиоксидантной способности, вопрос об оптимальной методике остаётся открытым [12]. Мы оценивали антиоксидантный статус при помощи параметра TRAP (total radical-trapping antioxidant parameter), который использовался в моделях ишемии-реперфузии на крысах [8], применяя методику аналогичную ранее описанной для определения антиоксидантной способности у собак с РЗЖ [12].

В последнее время высокомобильный групповой белок box 1 (HMGB1) рассматривается в качестве маркера повреждения тканей при ишемии-реперфузии у собак и у людей [10]. Он представляет собой ядерный белок, действующий как провоспалительный цитокин, пассивно высвобождаясь при некрозе клеток [3]. Зависимость между синтезом лактата и некрозом стенки желудка была описана de Papp и колл. [2]. Цель нашего исследования — определить антиоксидантную способность организма у собак с РЗЖ при ишемии и реперфузии, установить корреляцию между этим параметром, уровнями белка HMGB1 и лактата и тяжестью заболевания, а также проанализировать корреляции между изучаемыми параметрами.

Материалы и методы

Животные

Работа выполнена на 14 собаках с РЗЖ (6 сук, одна стерилизована, и 8 кобелей, один кастрирован), которые проходили лечение в клинике Ветеринарно-фармакологического университета Брно. Средний вес животных — 43 кг, средний возраст — 6 лет. Применялись обычные терапевтические и хирургические методы с гастропексией по индивидуальным показателям. Контрольную группу составили 6 собак сотрудников университета.

Образцы крови

Кровь из яремной вены брали до операции (период ишемии) — в пробирки с цитратом, гепарином или активатором свёртывания крови — и через 10 часов после операции (период реперфузии). Образцы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин и хранили при –20°C.

Анализ параметра TRAP

Реакцию с пероксил радикалом оценивали методом люминол-зависимой хемилюминесценции как описано ранее [1]. Кратко: хемилюминесцентный сигнал возникает в результате образования люминола по мере того, как в ходе термального распада 2,2-азо-бис-2-аидино-пропана гидрохлорита (ABAP, Polyscience, США) образуются свободные радикалы. Хемилюминесценция затухает параллельно разрушению пероксил радикалов антиоксидантами и появляется после истощения системы антиоксидантов. Значение параметра TRAP определяется как период времени, в течение которого в образце плазмы нейтрализуются пероксил радикалы. В качестве контроля вместо сыворотки брали тролокс (8,0 нмоль, Sigma-Aldrich, США), который представляет собой водорастворимый аналог токоферола.

Определение белка HMGB1

Белок определяли в сыворотке методом иммуноферментного анализа, используя набор реактивов ELISA kit (IBL International GmbH, Германия).

Определение лактата

Концентрацию лактата измеряли в гепаринизированной плазме на анализаторе DPC Konelab 20i (Thermo Fisher Scientific, Финляндия).

Шкала оценки

Степень повреждения тканей в результате ишемии-реперфузии зависит от длительности и интенсивности ишемии. Началом ишемии считали момент проявления клинических признаков. Интенсивность ишемии оценивали исходя из приблизительной величины угла заворота желудка (90°, 180°, 270°, 360°), определяемого хирургом. Тяжесть заболевания выражали как произведение периода ишемии на её степень.

Статистический анализ результатов

Данные обрабатывали в программе Microsoft Excel. Приведены минимальные, средние и медианные значения параметра TRAP, а также концентраций лактата и белка HMGB1 для контрольной группы, для ишемии (TRAPi, HMGB1i, лактатi) и реперфузии (TRAPr, HMGB1r, лактатr). Данные представлены как среднее значение ± СО. Рассчитывали различия (Δ) значений TRAP, HMGB1 и лактата при ишемии и реперфузии. Для оценки корреляции использовали коэффициент Пирсона, для проверки значимости различий — критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при р<0,01.

Результаты

Анализ параметра TRAP

У здоровых собак среднее значение параметра TRAP cоставило 273±122 мкмоль/л, при реперфузии — 363±307 мкмоль/л. Статистически достоверных различий по данному параметру между контролем и животными с РЗЖ не отмечено ни при ишемии (TRAPi, р=0,77), ни при реперфузии (TRAPr, р=0,58). Величины TRAPi и TRAPr достоверно не отличались (р=0,32). Минимальные, максимальные и медианные значения TRAP приведены на рис. 1. Значение TRAPr уменьшилось у шести и увеличилось у восьми собак.

Рис. 1. Величина параметра TRAP. Линиями указаны минимальные и максимальные значения; прямоугольниками — 1-ая, медианная и 3-я квартиль. 1 — контрольная группа, 2 — период ишемии, 3 — период реперфузии.

Значения HMGB1

При ишемии отмечены достоверные различия в величине HMGB1 между группой контроля и животными с РЗЖ (р<0,01). В контроле среднее значение HMGB1 составило 0,54±0,65 нг/мл. При ишемии — 4.91±4.17 нг/мл (HMGB1i), при реперфузии — 12,87±20.62 нг/мл (HMGB1r). На рис. 2 приведены минимальные, максимальные и медианные значения данного параметра. Установлена сильная статистически значимая корреляция между величинами TRAP и HMGB1r (r=0,82, р<0,01). Остальные корреляционные зависимости представлены в таблице 1.

Рис. 2. Концентрация белка HMGB1. Линиями указаны минимальные и максимальные значения; прямоугольниками — 1-ая, медианная и 3-я квартиль. 1 — контрольная группа, 2 — период ишемии, 3 — период реперфузии * Достоверное отличие от контроля.

Таблица 1. Параметр TRAP и концентрация белка HMGB1: значения коэффициента корреляции Пирсона

TRAPr — значение TRAP после реперфузии, ΔTRAP = TRAPi (значение при ишемии) – TRAPr. HMGB1i — значение HMGB1 при ишемии, HMGB1r — значение HMGB1 после реперфузии, ΔHMGB1 = HMGB1i – HMGB1r

Концентрация лактата

Обнаружены достоверные различия по концентрации лактата (р<0,01) между здоровыми и больными собаками в периоде ишемии. Среднее значение составило 3,35±2,13 ммоль/л при ишемии (лактатi) и 3,27±3,52 ммоль/л при реперфузии (лактатr). Средняя величина в контрольной группе — 1,45±0,34 ммоль/л. Минимальные, максимальные и медианные величины показаны на рис. 3. Корреляция между начальным уровнем лактата, параметром TRAP и концентрацией белка HMGB1 не установлена. При реперфузии отмечена сильная корреляция между концентрациями лактата и HMGB1r (r = 0,93, р<0,01); остальные результаты показаны в таблице 2.

Рис. 3. Концентрация лактата. Линиями указаны минимальные и максимальные значения; прямоугольниками — 1-ая, медианная и 3-я квартиль. 1 — контрольная группа, 2 — период ишемии, 3 — период реперфузии *Достоверное отличие от контроля.

Таблица 2. Лактат, параметр TRAP и концентрация белка (HMGB1): значения коэффициента корреляции Пирсона

Лактатr — концентрация лактата после реперфузии; Δлактат = лактатi (концентрация лактата при ишемии) − лактатr; HMGB1i — значение HMGB1 при ишемии; HMGB1r — значение HMGB1 после реперфузии; ΔHMGB1 = HMGB1i − HMGB1r, TRAPr — значение параметра TRAP после реперфузии.

Тяжесть заболевания

Обнаружена сильная статистически значимая корреляция между тяжестью заболевания и параметром TRAPr (r=0,81, р<0,01) или TRAP (r=0,83, р<0,01), а также между тяжестью заболевания и концентрацией белка HMGB1i (r=0,85, р<0,01), HMGB1 (r=0,87, р<0,01), лактата (r=0,71, р<0,01) и лактатаr (r=0,83, р<0,01). Самая сильная корреляция установлена между тяжестью заболевания и концентрацией белка HMGB1r (r=0,92, р<0,01).

Обсуждение

Работы по определению антиоксидантной способности организма собак немногочисленны. Изменения параметра TRAP по сравнению с контролем отмечены у больных животных в периоде ишемии, а также в раннем (1−4 часа) и позднем (1−4 дня) периодах реперфузии [8]. Наши данные указывают на отсутствие достоверной разницы между группой собак с РЗЖ и контролем по антиоксидантной способности при ишемии. Аналогичные результаты были получены на собаках Walker и колл. [12], которые измеряли способность поглощения свободных радикалов кислорода (ORAC), т. е. использовали метод, схожий с определением параметра TRAP. Значения ORAC располагались в пределах нормы, исходя из данных, опубликованных Freeman и колл. [4]. В отличие от других результатов по РЗЖ, увеличение параметра TRAP наблюдалось при ишемии кишечника у крыс [8].

В экспериментальных работах величина TRAP возрастала в ходе ранней реперфузии. Предполагается, что увеличение TRAP связано с высвобождением антиоксидантов из их депо [8]. В нашем исследовании не обнаружено достоверных различий между параметром TRAP в периоде ишемии (или в контроле) и реперфузии, несмотря на значительный разброс значений при реперфузии. У восьми собак отмечено увеличение параметра TRAPr, его уменьшение — у шести других. Причины данного явления неясны.

Мы не анализировали данные по антиоксидантной способности в позднем периоде ишемии, но в работах Walker и колл. [12] показано увеличение параметра TRAP после первого дня реперфузии, аналогичную тенденцию наблюдали Slavikova и колл. [8] после двухдневной реперфузии.

Согласно нашим данным, концентрация белка увеличивается в группе собак с РЗЖ. Сильная корреляция между HMGB1r и TRAP может отражать высвобождение данного белка при гибели клеток, обусловленной повреждением в ходе ишемии-реперфузии. Наши результаты согласуются с данными Tsung и колл. [10], которые обнаружили повышающую регуляцию экспрессии HMGB1 при ишемии-реперфузии у мышей. Однако они не смогли выявить HMGB1 в сыворотке крови. Нельзя исключать возможности ложноположительного HMGB1 в результате гибели клеток при хирургическом лечении, так как в данном исследовании отсутствовала группа контроля хирургического вмешательства. Повышение уровня HMGB1 наблюдали Ishida и колл. [5] через 72 часа после при овариогистерэктомии. Небольшое повышение уровня белка HMGB1 наблюдалось в течение первых суток, но исследование в этом плане было ограничено числом животных с заболеванием. Мы также показали повышение уровня HMGB1 и его корреляцию с повреждением тканей при ишемии реперфузии, которое оценивали по параметру TRAP и тяжести заболевания.

Лактат является продуктом анаэробного гликолиза при гипоксии тканей, и повышение его концентрации говорит о нарушении механизмов утилизации данного метаболита. Концентрация и кинетика лактата являются прогностическим параметром и маркером некроза стенки желудка у собак с РЗЖ [2; 13]. Вероятность неблагоприятного исхода возрастает, если при поступлении в клинику концентрация лактата превышает значение 6 ммоль/л [2] или 9 ммоль/л [13]. У двух собак, которые погибли в ходе нашего исследования, концентрация лактата составила 8,4 и 5,66 ммоль/л. Ранее мы показали, что концентрация лактата коррелирует с уровнем HMGB1i [11]. В данной работе обнаружена лишь умеренная корреляция между этими параметрами (r=0,50), что обусловлено, вероятно, относительно небольшим количеством животных в группе, так как в долговременном исследовании на собаках с РЗЖ (n=25) была установлена сильная корреляция (r=0,75) между уровнем лактата и HMGB1i [данные не опубликованы]. Кроме того, существуют некоторые различия в кинетике лактата и HMGB1, которые могут влиять на отсутствие сильной исходной корреляции между ними. Чувствительность концентрации лактата, равная 6 ммоль/л, относительно некроза стенки желудка составляет всего 61%, а её специфичность — 88% [2]. На основании этих данных мы провели анализ корреляции между уровнем лактата с одной стороны и параметром TRAP и уровнем белка HMGB1 с другой. При отсутствии корреляции между исходной концентрацией лактата и этими параметрами установлена сильная корреляция между антиоксидантным статусом (параметр TRAP) в периоде реперфузии и уровнем лактата (r=0,82) и концентрацией белка HMGB1 (r=0,83). Несмотря на это, HMGB1r сильно коррелирует с тяжестью заболевания, хотя наша бальная система её оценки может быль несколько субъективной. При синдроме РЗЖ как лактат, так и свободные радикалы кислорода могут генерироваться другими тканями в состоянии гипоксии, обусловленной шоком, и общее состояние организма может влиять на результаты анализа параметров периферической крови. В экспериментах с измерением АФК, TRAP, HMGB1 и лактата необходим одновременный забор крови из портальной и периферических вен.

Литература

1. Cizova H, Papezikova I, Kubala L, Lojek A, Ciz M, 2006. Increased antioxidant capacity of serum did not pre-vent lipid peroxidation in the intermittent ischemia-reperfusion of rat small intestine. Digestive Disease and Sciences 51, 657–661.
2. de Papp E, Drobatz KJ, Hughes D, 1999. Plasma lactate concentration as a predictor of gastric necrosis and survival among dogs with gastric dilatation-volvulus: 102 cases (1995 1998). Journal of American Veterinary Medical Association 215, 49–52.
3. Erlandsson HH, Andersson U, 2004. Mini-review: The nuclear protein HMGB1 as a proinflammatory mediator. European Journal of Immunology 34, 1503–1512.
4. Freeman LM, Rush JE, Milbury PE, Blumberg JB, 2005. Antioxidant status and biomarkers of oxidative stressin dogs with congestive heart failure. Journal of Veterinary Internal Medicine 19, 537–541.
5. Ishida A, Ohno K, Fukushima K, Nakashima K, Takahashi M, Goto-Koshino Y, Fujino Y, Tsujimoto H, 2011. Plasma high-mobility group box 1 (HMGB1) in dogs with various diseases: Comparison with C-reactive protein. Journal of Veterinary Medical Science 73, 1127–1132.
6. Layton ME, Pazdernik TL, 1993. Reactive oxidant species in rat brain extracellular fluid. In: Tarr M, Samson F (eds.): Oxygen Free Radicals in Tissue Damage. Birkh user, Boston. 105–131.
7. Monnet E, 2003. Gastric dilatation-volvulus syndrome in dogs. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice 33, 987–1005.
8. Slavikova H, Lojek A, Hamar J, Duskova M, Kubala L, Vondracek J, Ciz M, 1998. Total antioxidant capacity of serum increased in early but not late period after intestinal ischemia in rats. Free Radical Biology and Medicine 25, 9–18.
9. Thomas S, Balasubramanian KA, 2004. Role of intestine in postsurgical complications: involvement of free radicals. Free Radical Biology and Medicine 36, 745–756.
10. Tsung A, Sahai R, Tanaka H, Nakao A, Fink MP, Lotze MT, Yang H, Li J, Tracey KJ, Geller DA, Billiar TR, 2005. The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injury after murine liver ischemia-reperfusion. Journal of Experimental Medicine 201, 1135–1143.
11. Uhrikova I, Rehakova K, Rauserova-Lexmaulova L, Doubek J, 2011. Initial HMGB1 values in dogs with gastric dilatation and volvulus a pilot study. In: Veterinary and Comparative Clinical Pathology Conference Proceedings, Dublin, Ireland, 32.
12. Walker TG, Chan DL, Freeman LM, Milbury PE, Blum-berg JB, 2007. Serial determination of biomarkers of oxidative stress and antioxidant status in dogs with naturally occurring gastric dilatation-volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care 17, 697–802.
13. Zacher LA, Berg J, Shaw SP, Kudej RK, 2010. Association between outcome and changes in plasma lactate concentration during presurgical treatment in dogs with gastric dilatation-volvulus: 64 cases (2002– 2008). Journal of American Veterinary Medical Association 236, 892–897.

Источник: Veterinarni Medicina (2012), 57, No. 4, 207–211. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

СВМ № 6/2012

Вам также могут быть интересны статьи:

Диссеминированное внутрисосудистое свёртывание крови у собак с синдромом острого расширения и заворота желудка

Гипокальциемия у собак и кошек